绿色荧光蛋白的表达及粗提取.ppt

* * * * * * * 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 博学笃行 尚德济世 快开矿 博学笃行 尚德济世 主讲人： 绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆、表达及粗提取 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 绿色荧光蛋白简介 1.一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白 2. GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr 3.1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现这种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 绿色荧光蛋白优点 ①荧光强度高，稳定性高； ②分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠； ③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达； ⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域 1.仪器：恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪，移液器、电泳槽、振荡器、制冰机、凝胶成像仪，水浴锅，高压灭菌锅、振荡培养箱，手持式紫外灯 2.试剂：BamH I；NotI(10U/μL)；T4 ligase；LB培养基；溶液Ⅰ；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；TE缓冲液；20×TBE；GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液 ；1×TBE缓冲液 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 仪器与试剂 研究背景 研究思路 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 1.质粒DNA的分离与纯化 01 质粒DNA的分离与纯化 02 酶切及连接 03 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 04 GFP蛋白的诱导表达. 05 绿色荧光蛋白的粗提取 步骤一 步骤二 步骤三 步骤四 步骤五 主要步骤 1.1细菌的生长和质粒的扩增 1.2碱提取法 1.3质粒DNA的提纯 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 1.质粒DNA的分离与纯化 ? 2.酶切及连接 双酶切 1 质粒酶切产物的鉴定 2 回收酶切产物 3 连接 4 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 2.1双酶切 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 反应物（μL） pEGFP-N3 pET-28a 质粒 18 18 BamH I 2 2 Not I 2 2 10×buffer K 3 3 0.1%BSA缓冲液 3 3 ? 2.4 连接 目录 contents 研究现状 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 反应物 体积/μL 回收纯化的pET-28a质粒 5 gfp基因片段 12 T4连接酶 1 缓冲液（10×） 2 DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团（-P） 3.1感受态细胞的制备 (CaCl2法) 3.2转化涂板 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 3.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 4.GFP蛋白的诱导表达 1.IPTG（异丙基硫代β-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。 2.GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。 紫外灯下的绿色荧光蛋白 目录 contents 仪器与试剂 研究思路 研究方法 预期结果 参考文献 研究背景 ? 4.GFP蛋白的诱导