第七章噬菌体-2010下.ppt

* * 6、烈性噬菌体的一步生长曲线 （4）保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）； Ellis and Delbruck, 1939， T2噬菌体 （1）用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞； （2）数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）； （3）将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞； （5）以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线； 一步生长曲线 病毒增殖的2个特征性数据：潜伏期与裂解量 潜伏期与裂解量 裂解量：每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。其值等于稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目除以潜伏期受染细胞的数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。 潜伏期：从噬菌体吸附于细胞到释放出新噬菌体的最短时期。 为何有潜伏期？ 为何是一步生长？ 温和噬菌体与溶源性 温和噬菌体在吸附和侵入宿主细胞后，将噬菌体基因组整合在宿主染色体上（或以质粒形式存在细胞内）。 随宿主DNA复制而同步复制，随宿主细胞分裂而传递到两个子细胞中。 宿主细胞则可正常生长繁殖。 以上过程称为“溶源周期”。溶源性是指温和噬菌体侵入宿主细胞后产生的上述特性。 原噬菌体 ：整合于细菌染色体上或以质粒形式存在于细菌细胞内的温和噬菌体基因组。 温和噬菌体与溶源性 含有温和噬菌体的 DNA 而又找不到形态上可见的噬菌体粒子的宿主细菌叫溶源性细菌。 但在一定条件下，噬菌体可进行复制，产生并释放子代噬菌体，进入“裂解周期”。 溶源周期和裂解周期 λ噬菌体的整合 位点attP与attB Gateway克隆技术 DE3 溶源性细菌的基本特性 (3)免疫性 溶源性细菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源噬菌体不敏感，外来的同源噬菌体不能增殖，也不导致溶源性细菌裂解。 (1)自发裂解　在自然情况下，溶源性细菌可发生低频裂解，一般仅有10－2～10－5个细胞发生自发裂解。可用于检测溶源性细菌； (2)诱导裂解　溶源性细菌在理化因子（如紫外线、氮芥等）的作用下，可发生较高频裂解。 皮之不存，毛之焉附？ 溶源性细菌的基本特性 (5)复愈性 溶源性细胞有时消失了其中的原噬菌体，变成非溶源性细胞，这时即不发生自发裂解也不发生诱发裂解。在溶源性细菌的繁殖中，可能有10－5个细菌丧失其原噬菌体，而恢复成为原来的非溶源性细菌。 (4)溶源转变 少数溶源性细菌，由于整合了温和噬菌体基因组，因而产生了除免疫性以外新的表型性状的现象。包括溶源菌细胞表面性质的改变和致病性转变被称为溶源转变。（Lysogenic or phage conversion） 白喉棒杆菌 三、噬菌体研究方法 1、噬菌体粒子的性质 2、噬菌体的培养与纯化 3、噬菌体滴度的测定 1、噬菌体粒子的性质 （1）噬菌体的形态结构 （2）噬菌体的化学组成 （1）噬菌体的形态结构 （2）噬菌体的化学组成 蛋白质外壳 一团能够自主复制的遗传物质 囊膜（φ 6） 特殊的侵入方式 外壳蛋白的功能 感染的特异性； 构成病毒的蛋白质外壳，保护核酸； 表面抗原。 噬菌体的蛋白质 （2）非结构蛋白：复制过程中所产生并具有一定功能，但不存在于噬菌体颗粒中的蛋白质，如调节蛋白和复制酶。 （1）结构蛋白：构成一个形态成熟、有感染力的病毒颗粒所必须； 壳体蛋白与存在于噬菌体颗粒中的酶 噬菌体复制过程中产生的酶 参与病毒对宿主细胞的入侵； 参与病毒复制过程中所需要病毒大分子的合成（如逆转录酶等 按功能划分： 2、噬菌体的培养 噬菌体的培养： 二元培养物法 噬菌体的纯化 纯化噬菌体的要求 保持其感染性 均一性 纯化噬菌体的方法 单斑纯化—负菌落 3、噬菌体滴度的测定 （1）噬菌体的物理颗粒计数 （2）噬菌体的感染性测定 （1）噬菌体的物理颗粒计数 ELISA： A A p3决定感染性，p8是主要的外壳蛋白，抗体的靶标 （ 2 ）病毒感染性的测定 双层琼脂法测定噬菌体的效价（plaque forming unit，pfu） 四、噬菌体的应用 医学上的应用 噬菌体展示 细菌的鉴定 – 噬菌体分型 Staphylococcus 重组DNA载体 为动物病毒的研究提供借鉴 酶： T4 DNA ligase、T7 RNA polymerase 医学应用 “I strongly believe phage could become an effective antibacterial tool” - Carl Merril, Chief of the