brdu抗血清制备和应用的研究.pdf

遗 传 学 报， 19。);289 AetaCeneticaSinica BrdU抗血清制备和应用的研究 I．高度特异的BrdU抗血清的制备与特性 楼庄伟 尚克刚 吴鹤龄 （北京大学生物学系 100871) 半抗原BrU通过与 BSA偶联制备了完全抗原，经过光吸收、SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳 和琼脂糖凝胶电泳的测定表明，核昔一蛋白质复合物符合制备的要求，每个 BSA上估计大约 平均有 10.3个 BrU。用常规免疫的方法获得兔抗 BrdU的抗血清，与 BrU-EA的双向扩散 效价高达32。抗血清稀释 128万倍时仍可见明显的 ELISA 阳性反应。与以前所报道的 BrdU抗血清不同，该抗血清具有高水平的识别能力，已达到BrdU单克隆抗体的识别水平， 无须纯化即可用于染色体及核酸的研究。 关键词 BrdU，抗血清，兔 从七十年代开始，非放射性的核营掺人技术取得重要的进展，人们可以利用，一嗅脱 氧尿q9t核普 (BrdU）与胸腺qa} (Thd)在结构上的相似性，用 BrdU替代 Thd掺 人到DNA分子中，再经过特殊的处理显现出区分着色。BrdU掺入技术已广泛用于细 胞周期，复制顺序，SCE等方面的研究，但在区分着色、灵敏程度和着色机理等方面也还 尚有不尽人意之处。如能使用高度专一的抗BrdU的抗体，再如生物素一核酸技术那样 借助高度灵敏的免疫酶技术，就可以十分灵敏而又高度专一的显示出含 BrdU的核酸片 段或被 RrdU掺人的核或染色体区域，从而使上述两种技术融为一体。 这一步骤的首要环节是抗 BrdU抗体的制备。 早在 1971年 Sawicki等人就已开 始了BrdU抗体的制备183［9Gratzner曾制备了BrdU抗血清，由于该抗血清与 Thd有 弱反应，应用BrdU抗血清的试验没有得到令人满意的结果13-61oGratzner(1982）报道， 成功的制备了抗 BrdU的单克隆抗体，它仅与 BrdU和5--碘脱氧尿普 (1dU）发生识别 反应。Gonochoroff(1985）报道的伉 BrdU单克隆抗体 BU--1能够识别未变性 DNA 分子中的BrdU(21。近年来，该抗体的应用研究日趋增多，研究的领域也日趋广泛，取得 了令人耳目一新的结果。目前，在一些报道中已开始使用商品化的抗 BrdU单克隆抗体 进行研究工作7,9‘,ioj，但其价格十分昂贵。国内目前尚无BrdU抗体的报道，因此，为开展 和推广 BrdU抗体制备及其应用的研究，本文报道使用 BrU与蛋白质的偶联复合物作 为免疫原获得与单抗相同效能的BrdU抗血清。 材 料 和 方 法 一（）BrU-BSA 复合物的制备 本文于1990年 12月24日收到。 290 遗 传 `f‘} 报 19卷 5-澳尿嚓咙核营 (BrU,SIGMA)25mg加人O.1mol/L高碘酸钠溶液2.5ml中，20 分钟后加入0.15ml乙二醇，在加人牛血清白蛋白 B（SA,SIGMA）水溶液5ml(28mg/ MI)后，用5/a碳酸钾调 PH9-9.5，搅拌45分钟。随后加人 I5mg/ml硼氢化钠水溶 液5ml,混匀后静置 18小时。加人lmol/L 甲酸2.5ml,1小时后用lmol/L氢氧化铁调 PH 为8.5,所得溶液对蒸馏水透析36小时。冰冻干燥保存。 （二）BrU-EA 复合物的制备 卵清蛋白 E（A，上海生化所）偶联 BrU的程序与BrU-BSA大致相同，仅在加人硼 氢化钠后省去酸处理，直接用氢氧化镶调PHo （三）免疫兔 青紫兰兔6只，2.2-2.5kg，北京大学实验动物中心提供。每只兔每次注射抗原量为 1.5mg。脚掌、皮下注射常规法免疫。 （四）ELISA 测定 为侧定血清效价，使用64孔培养板，包埋抗原时，每孔加 10z1g/mlBrU-EA 的PBS 溶液l00fzl；对照孔加 100pttPBS;10沁马血清封闭；每孔加兔抗 BrdU血清10091（以 PBS稀释 1.6万倍为起始浓度），过氧化物酶标羊抗兔 IgG80川 (1万倍稀释，北京生物 制品所），