生化技术biochemical technique 上海第二医科大学检验系临床生化与 .ppt

内容： 生物大分子的一般制备 分子生物学的基本操作 生物大分子制备的四个阶段 选择材料和预处理 组织细胞的破碎及细胞器的分离 生物大分子的分离纯化 浓缩、干燥和保存 （一）材料选择和预处理：微生物 植物 动物 研钵（加净砂或玻璃粉） 高速组织捣碎器 超声波 渗透压法 反复冻融法 （2）等电点沉淀法（溶解度最小） PI MW Alb 4.86 66 000 α1 5.02 130 000 α2 5.02 200 000 β 5.12 1 300 000 γ 6.8~7.3 1 500 000 琼脂糖凝胶电泳 从海藻中提取出来的一种线状高聚物，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成三维空间结构。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）丙烯酰胺结构式 等电聚焦电泳 载体两性电解质 离子交换层析法 （四）浓缩、干燥、保存 [样品的浓缩] 1、减压加温蒸发浓缩 2、空气流动蒸发浓缩 3、冰冻法 4、吸收法 5、超滤 [干燥] 真空干燥——适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存。 冷冻干燥——在相同压力下，水蒸汽压力随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。 [保存] 1、干燥制品的贮存 2、液态贮存 样品不能太稀 一般需加入防腐剂、稳定剂 低温贮存 三、 分子生物学技术 重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离 小结： 1、掌握生物大分子的制备分离纯化的方法； 2、熟悉生化技术的定义和特点； 3、了解生化技术的应用发展趋势。 思考题： 1、常用组织细胞破碎的方法有哪些？ 2、请列举生物大分子分离纯化的方法，并分别简述其原理。 ? 参考书目： 赵永芳主编《生物化学技术原理及其应用》第二版；第三版 分离血浆脂蛋白 脂质 蛋白质 直径 CM 98% 2% 100 VLDL 90% 10% 75 LDL 70% 30% 20 HDL 50% 50% 10 加样槽 β 前 β α CM LDL VLDL HDL — + — + （2）亚甲双丙烯酰胺 4.根据配体特异性的分离法： 亲和层析 5.根据被分离分子的密度 --离心技术 【鉴定】检测--光谱分析法  RNA DNA 260nm 蛋白质 280nm DNA的提取：组织、细胞、质粒RNA的提取：组织、细胞PCR技术：常规PCR、RT-PCR限制性内切酶Western blot 四.生化技术的特点： 1.条件温和 2.实验条件与机体内环境尽 量符合 五.生化技术的应用：1.工业、农业研究、生产2.生化研究3.临床应用、诊断 六.发展趋势：超微量高效自动化快速综合联用 比色-- 计算机 * * 生化技术Biochemical Technique上海第二医科大学检验系临床生化与生化技术检验 一.什么是生化技术？ 生化技术是研究生物体的化学组成、结构、功能以及在生命活动中化学物质的代谢、调节控制等的实验方法。 ?分离纯化检测生物大分子 电泳 Electrophoresis  层析 Chromatography 离心 Centrifugation  检测 光谱分析法 分离 二.生物大分子的一般制备法 体液： 直接分离生物样品  组织细胞：先破细胞?分离? 检测 （二）组织细胞破碎的方法：1.物理方法： 玻璃匀浆器(homogenizer) 2.化学方法 有机溶剂（破坏细胞膜的脂质 双分子层）3.酶法 自溶法（蛋白酶、酯酶） 酶解法（溶菌酶破坏细胞壁的 ?-1，4-糖苷键） （三）生物大分子的分离、纯化 以蛋白质为例【提取】相