Ct值：PCR扩增过程中.PPT

* * * * * * * * * 实 验 流 程  SYBR Green法实验流程 样本处理 RNA提取 qPCR 数据分析 逆转录 样本处理与RNA提取 外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ RT-PCR一步法还是两步法？ 两步法: 反转录和PCR扩增分两步进行。 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检测 多个基因。便于反应优化。在工作的初期。 一步法：反转录和PCR扩增在同一管内完成。 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。在工作的成熟阶段。 荧光定量PCR体系 Template Primers DNA聚合酶 Buffer and dNTPs Dye 总原则与普通PCR相同： 避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 - 300bp) 推荐做跨intron设计 引物设计原则 Master mix 使用Master mix有效降低系统误差 -- 热启动酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10min Fast Hotstar 抗体修饰，热复活仅需几十秒 -- Buffer 反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂 -- Dye Real SYBRGreen mix RealSuper mix Master mix的优化 新型荧光染料(Super Green) 激发、发射波长与SYBR Green近似 对PCR反应抑制更轻微 可使用较高浓度(1uM, SYBR green 0.3uM)更亮，灵敏度更高 较短的链延长时间 对小片段DNA和ssDNA结合更弱 减少背景，有效信号更强 与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于HRM分析 化学性质更稳定 致突变性与毒性更弱 SYBR Green Super Green Master Mix ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 有不同系统，需参照仪器要求选择。 误差控制 使用Master mix 配置预混体系 设置生物学重复（不同个体） 技术性重复（复孔） 阳性和阴性对照 实验环境控制 试剂准备区 核酸制备区 反应液制备区 荧光定量PCR反应区 荧光定量PCR体系 数据分析 融解曲线：单一特异性产物 扩增曲线： -- Ct值大小 -- 各复孔之间重复性 -- 不同浓度梯度稀释的间隔性 标准曲线： -- R2＞0.980或∣ r ∣ ＞0.990 -- 反应效率尽可能高：90%-110% -- 目的基因的扩增效率接近内参基因 操作注意事项 为避免加样误差，保证重复性，配制预混体系 配制反应体系时，液体要缓慢加至管底，减少吹打 低速离心，充分混匀，如有气泡短暂离心 不要直接在八连管上进行标记 避光保存，试剂分装避免反复冻融 酒精擦拭移液器的吸头 设置反应重复（至少二个） 设置对照 案例分析 总体原则 偶然因素 -- 操作原因 实验重复 – 生物学重复、技术性重复 机器因素– 仪器加样孔 结合扩增曲线、融解曲线、标准曲线分析 单孔和多孔分析 内参基因和目的基因对比分析 案例分析– 扩增曲线 曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。 扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象。 模板进行梯度稀释时，各浓度间隔性好。?? Ct 15-35 重复性? 扩增曲线 -- 低浓度样本没有稀释好 -- 重复性差，加样存在误差 案例分析– 扩增曲线 案例分析– 扩增曲线 无信号或Ct值偏大 内参基因和目的基因均无信号 -- RNA降解 内参基因和目的基因均偏大 -- 模板量低 -- 对未知浓度的样品应从稀释最高浓度做起 内参基因正常，而目的基因偏大或无信号 -- 引物设计 -- 目的基因表达量低 案例分析 Q．内参基因与目的基因的Ct值之差在多大范围内可以接受？ A： -- 在使用2-△△Ct法计算的前提是，公式成立的条件是内参基因和目的基因的扩增效率相接近并且足够高，在90%-110%之间，因此内参基因与目的基因的差值是可以接受的。 --