多功能水平电泳仪Multiphor II 在等电点检测中的应用 - 生物通.PDF

多功能水平电泳仪Multiphor II 在等电点检测中的应用 多功能水平电泳仪Multiphor II是一套标准化组合设计的，适用于各种电泳技术的系统。它不仅适 用于常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）、双向电泳对蛋白组进行分析、核酸电泳对PCR产物和DNA 片段进行分析鉴定。同时，Multiphor II还提供等电聚焦电泳和蛋白质转印模块，真正实现了电泳仪的 多种功能性，受到越来越多科研工作者和检验人员的青睐。在这里，我们对Multiphor II在等电聚焦电 泳方面的应用作个介绍。 一、Multiphor II在生物制品等电点检测中的应用 在生物医药迅猛发展的同时，国家对于生物制品的标准和规范要求也日益提高。在中国人民共和 国最新第九版药典的第三部生物制品中，新增37种，修订94种，修订比例为72% ，严格规范了疫苗类 制品、血液制品、用于血源筛查的体外生物诊断试剂以及国家食品药品监督管理局规定的其他生物制 品，对于每批制品出厂上市或者进口时进行强制性检验、审核的要求。 在生物制品检定环节，SDS电泳法(见药典附录IV C)、等电聚焦(见药典附录IV D)、紫外可见 分光光度法(见药典附录II A)、免疫印迹(见药典附录VIII A)和蛋白质测定法第二法(见药典附录VI B)这五 种技术手段，在病毒收获物、原液检定和成品检定的各个阶段都发挥着非常重要的作用。以等电聚焦 电泳法(IV D)为例，在注射用重组人促红素、干扰素等32种生物药品检定方法中，作为等电点测定方 法，被广泛采用。 二、Multiphor II 在兴奋剂检测中的应用 肽类激素兴奋剂，如促红细胞生成素（EPO）及其类似物、生长激素（hGH）及其类似物，具有 外源性药物（肽类兴奋剂）与内源性激素（人体自然生成）区别小、在人体内药物代谢时间短等特点， 曾长期无准确可靠的检测方法，而被运动员广泛滥用，也是反兴奋剂斗争中重点。Multiphor II在等电 聚焦上出色的分辨能力及高通量特点使之成为肽类兴奋剂检测中的有力武器之一。2012伦敦奥运会 和残奥会的兴奋剂检测在英国埃塞克斯郡哈罗的反兴奋剂科学中心开展，采用的便是使用Multiphor II 进行等电聚焦电泳，联合GE化学发光检测平台ImageQuant LAS 4000完成重组EPO的检测，为比赛的 公平展开提供有力的保障。 从检测方法上看（见图1），由于促红细胞生成素是一种糖蛋白，该方法是基于重组和内源性 EPO电荷上的微小差别，利用等电聚焦电泳 （IEF）、免疫印迹、化学发光检测等技术来提高不同糖蛋 白的分离效率和检测的灵敏度。具体来说包括以下几个步骤：首先进行样品制备，通过亲和层析，将 运动员的尿液或者血浆样品中的EPO通过其抗体进行亲和层析捕获，使大体积样品进行有效富集和浓 缩；浓缩后的EPO在Multiphor II上进行等电聚焦电泳，由于内源性EPO和重组EPO在电荷上有细微差别， Multiphor II在等电聚焦电泳上分辨率高，因此可以将它们分开；接着，将凝胶上的EPO通过转印至PVDF 膜上，对EPO进行Western Blotting蛋白印记杂交。最后，通过高灵敏化学发光成像仪ImageQuant LAS 4000对PVDF膜的化学发光信号进行成像，从而完成了重组EPO的初步检测。在验证方面，主要通过对 内源性和重组EPO在分子量和形状上的差异，利用SDS电泳对浓缩后的样品完成验证工作。 图1 兴奋剂（重组EPO）检测流程 从结果上看，采用等电聚焦电泳后，化学发光的成像结果可以划分为三个区域（见图2），分别是 酸性区、内源EPO区域和碱性区。其中内源EPO区域为尿液或者血浆样品中EPO的主要分布区域，分 为α 、β、γ 、δ 、ε等条带 （如图2中uEPO泳道）。rEPO条带主要分布在碱性区域，以1-6条带标识，其 中至少有三条连续，清晰地条带位于碱性区。运动员服用兴奋剂后，检测结果显示两条最浓的带也位 于碱性区，如果是血清样品，碱性区域条带的浓度比内源性区域至少高2倍。对于商品化的NESP和CERA ， 它们属于EPO的类似物，在等电聚焦图谱上，条带的分布与内源性EPO的条带分布差异更为明显，NESP 浓度最高的条带主要分布在酸性区域，如图2中以A 、B、C 、D所示。而CERA则主要分布在碱性区域， 至少有四条连续、清晰分布的条带，同rEPO相比，条带分布更紧密，有的甚至难以分开。 图2 化学发光检测重组EPO结果