牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立.pdfVIP

CloningandExpressingofE2GeneofBovine ViralDiarrhoea MucosalDisease VirusandPreliminaryDevelopmentofIndirect ELISA ADissertationSubmittedto ShiheziUniversity InPartialFulfillmentoftheRequirements FortheDegreeof MasterofAgriculture By LiuYu-cheng （PreventiveVeterinaryMedicine） DissertationSupervisor Prof.QiaoJun June,2014 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据 牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立 中文摘要 牛病毒性腹泻/粘膜病 （Bovine ViralDiarrhea/MucosalDisease，BVD/MD）是由牛 病毒性腹泻病毒 （Bovine ViralDiarrh Virus，BVDV）引起牛的以发热、消化道粘膜糜 烂、溃疡、脱落、出血性炎症、腹泻、白细胞下降、繁殖障碍为主要特征的一种传染 病。该病在养牛国家广泛流行，形成持续性感染，引起免疫抑制，易导致继发感染， 给畜牧业生产造成巨大的经济损失。目前，世界各国对于该病的防控主要通过采取动 物检疫、淘汰和免疫接种相结合的策略。在欧美发达国家釆取检疫和淘汰为主，免疫 接种为辅的方法来防控该病，使得该病得到有效控制。然而，我国由于缺乏理想的商 品化疫苗和检测产品，导致该病在我国很多地区广泛流行。因此，研发用于BVD 防 控的疫苗和检测试剂，制定并完善BVD 的防控体系对于保障我国养牛业的持续健康 发展具有重要的意义。 本研究以BVDV-2SW分离株为研究对象，对该病毒E2基因进行了克隆，运用大肠 杆菌和酵母表达体系表达E2基因，通过SDS和Westernblot分析表达的重组E2蛋白 的反应原性，选择表达量高且反应原性强的重组E2蛋白作为ELISA包被抗原，初步建立 了检测BVDV抗体的间接ELISA方法，为BVDV检测试剂的研发奠定前期基础。主要研 究方法和结果如下： 1.BVDVE2基因的克隆及原核表达。从BVDV-2SW株细胞培养液中提取病毒的 总RNA，采用RT-PCR方法从总RNA 中扩增出BVDVE2部分基因，扩增产物经EcoR I、NotI双酶切后插入原核表达载体pET-28a （+）和pET-32a （+）中，构建E2基因原 pET-28a-E2 pET-32a-E2 BL21 DE3 37 核表达载体 和 ；将其转化至工程菌 （ ）中，在 ℃、 1.0mmol/LIPTG浓度条件下诱导表达。SDS分析发现，在分子质量32kDa和44 kDa Westernblot E2 的位置出现与预期大小一致的蛋白条带； 分析表明表达的重组 蛋白