制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：.DOC

Inoue法制备感受态大肠杆菌总结 培养基的准备 SOB培养基： 100ml 胰化蛋白胨 2g 酵母提取物 0.5g NaCl 0.05g 250mM KCl 1ml 高压灭菌 使用前加 2mol/L MgCl2 0.5ml SOB琼脂板（含20mmol/L MgSO4 和20mmol/L 氨苄） 100ml 胰化蛋白胨 2g 酵母提取物 0.5g NaCl 0.05g 琼脂 1.5g 250mM KCl 1ml 高压灭菌 50℃温浴 再加 2mol/L MgSO4 1ml 2mol/L MgCl2 0.5ml 20mg/ml 氨苄 100ul 混均倒平板（90mm2） SOC培养液 50ml 胰化蛋白胨 1g 酵母提取物 0.25g NaCl 0.025g 250mM KCl 0.5ml 2mol/L MgCl2 0.25ml 1mol/L 葡萄糖(0.22um过滤除菌) 1mlINOUE转化缓冲液的准备：(250ml) MnCL2.4H2O 2.72g CaCL2.2H2O 0.55g 定容到250ml KCL 4.6625g PIPES(0.5mol/L,PH6.7) 5 ml 0.45μm孔径滤膜过滤，分50ml每份-20℃保存 挑取一个经37℃培养19h平皿上的单菌落（2-3mm直径），接种至250ml 锥形瓶中的25ml SOB培养液中，37℃摇床（250~300r/min）培养6~8小时。（此时培养物OD600约0。680） 从上述的25ml 的初始培养物接4ml大肠杆菌于盛有100ml SOB 的500 ml锥形瓶中，于18~22℃中速摇床过夜。 次日取出达到OD值0.55时的培养液置于冰浴中10min。 平均分装到两个50ml的贝克曼离心管于4℃以2500g 在贝克曼离心机上离心10min收集菌体。 倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体，用真空吸引器将贴附在管壁的培养基吸干。 加32ml冰预冷的Inoue转化缓冲液轻轻旋转重悬细菌(没有用枪吹吸和振荡重悬) 于4℃ 2500g离心10min 收集菌体。 倒去上层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min 以吸干剩余液体，用一真空吸引器将附在管壁上的培养基吸干。 冻存感受态细胞 11用8ml预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬沉淀(此时两管混合于一管)。 12向剩余的细胞中加0.6mlDMSO，混匀冰浴10min. 13迅速将悬液分装到冷却的无菌1.5ml离心管中（每管200ul），没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于-70℃备用。 转化 15要转化的PET加入装有感受态细胞（加DMSO保存于-70℃的感受态细胞）的管中，轻轻旋转几次混匀内容物。设一对照管：只有感受态细胞。冰浴30min [保存于-70℃的感受态细胞从冰箱拿出后用手心溶解后立即在冰浴上冰浴10min,然后再加INSERT DNA.] 16将管放入预加温到42℃的水浴中，恰恰放置90s，不要摇动。 17快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。 18每管加800μl在37℃培养箱中温浴到37℃的SOC培养基，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min（中速温和摇培），使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗标记基因。 19将200μl体积的已转化的感受态细胞转移到含抗生素和20mmol/L,MgSO4SOB培养基上。于37℃培养箱正放到液体被吸收。 20．倒置平皿12~16h后可出现菌落。 转化PET标准质粒的结果如下图: 图A 转化10μl浓度为50ng/μl的PET标准质图B转化2μl浓度为50ng/μl的PET标准质粒 图C 空白对照 分析：（仅与本人每次成功的经验为准，供参考） 1、本实验所用的菌株是XL1—BLEU ，注意不同种的大肠杆菌的各种参数不同。 2、培养基需新鲜配置，液体培养基的瓶子要专用，每次使用后洗净凉干后，锡铂纸封口，使用前只用清水洗后蒸馏水荡几遍，最后用超纯水润洗两遍。注意专用器皿都不用任何清洁剂，第一次使用时可以用稀的洗液浸泡。 3、培养初始培养物的培养基可以用SOB或LB，其它步骤中所用各培养基均用SOB（MgCl2需在使前加）。 4、大体积培养菌时如温度固定在18~22℃，有如下细菌