实验14-PCR技术的.ppt

PCR技术;一、聚合酶链式反应（PCR）概述;（二）发展历程 1971年 Kjell Kleppe提出PCR原始雏形 概念 1983年 Kary Mullis发明PCR技术 1987年 获得专利 1993年 诺贝尔化学奖; PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：; 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；;3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的片段富集106～109倍。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 ;变性（94度）;Y = Y0 * (1+X)n; PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。;四、PCR反应体系的主要成分和作用;（一）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶来源于嗜热水生菌的重组体，与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活性。 可分为两大类： 1、具有校正功能的（有3’→5’核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 2、不具有校正功能的 （无3’ →5’核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶;（二）模板 核酸模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。; （三）引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 ;设计引物应遵循以下原则： 1、引物长度一般15-30个bp，常用为20bp左右。引物过短过长都会使特异性降低。 2、引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3、引物碱基G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。碱基随机分布，避免5个以上的相同核苷酸的成串排列。 4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。; 5、引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 6、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 7、引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。; （四）dNTP的质量与浓度 　 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。;（五）PCR反应缓冲液 　组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2 Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。;（六）PCR反应标准体系;五、PCR的反应条件控制; 2、退火(