钙蛋白酶抑制剂对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤的保护作用论文.docVIP

　　钙蛋白酶抑制剂对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用论文 【摘要】 目的:研究calpain抑制剂（ALLN）对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。方法:45只雄性SD大鼠随机分为正常灌注组、缺血/再灌注组、ALLN+正常灌注组、ALLN+缺血/再灌注组和二甲亚砜+缺血/再灌注组,分别检测再灌注15 min时冠状动脉流出量（CF）和冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量，荧光分光光度计测定荧光强度来反映calpain活性，免疫印迹法检测心肌细胞calpain蛋白表达量，用流式细胞仪检测细胞内钙荧光强度和细胞凋亡率，并计算凋亡指数。结果：同缺血/再灌注组相比，ALLN+缺血/再灌注组CF显著增高（P 0.01），LDH漏出量、calpain活性和蛋白表达量、胞内钙荧光强度和细胞凋亡指数均显著降低（P 0.01）。结论:ALLN对离体心脏缺血/再灌注损伤有保护作用,可能与其抑制calpain活性，从而减轻calpain对细胞的损伤.freelia-reperfusion,I/R)损伤的影响，旨在探讨calpain在I/R损伤中作用及可能的机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂和仪器 calpain抑制剂(ALLN)、N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC、AMC、calpain单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的二抗、FLUO-3/AM FITC (美国Sigma公司)，SO)+I/R组，用含0.3%DMSO的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接着再用K-H液恢复灌注40 min。 1.2.2 乳酸脱氢酶(LDH)和冠状动脉流出量(CF)的测定 收集再灌注15 min时单位时间内的CF，并应用日立全自动生化分析仪测定冠脉流出液中LDH的漏出量。 1.2.3 心肌匀浆制备 去除心房和右心室，将剩余的心脏组织剪碎后加入10 ml·（g组织）-1匀浆液（10 mmol·L-1 NaHCO3，5 mmol·L-1NaN3，15 mmol·L-1Tris-HCl，pH 6.8），制成匀浆后离心（10 919 ×g，20 min），收集上清，分装储存于-70 ℃，以上操作均在4 ℃进行，蛋白浓度采用Bradford法测定。 1.2.4 calpain活性测定 我们以N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC（calpain特异性作用底物）与calpain 反应释放出AMC的荧光强度来代表不同样品中calpain的活性［2］。取150 μl的心肌匀浆液，加入1 ml的反应缓冲液（145 mmol·L-1NaCl,100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.3）37 ℃水浴箱中振荡10 min,再加入150 μl的500 μmol·L-1的N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC，在37 ℃水浴箱中振荡60 min 后取1 ml加入比色皿，在荧光分光光度计上用波长为360 nm的光线激发后，测定在440 nm处发射的荧光强度。用已知浓度的AMC作标准曲线，测得的结果以ngAMC·min-1·(mg蛋白)-1表示。 1.2.5 液（终浓度为5 mmol·L-1），混匀后避光37 ℃振荡30 min，去除负载液，用D-Hanks液洗涤3次，流式细胞仪参数设置激发波长488 nm，发射波长526 nm，每组样品取10 000个细胞，以平均荧光强度代表各组细胞内的钙离子浓度。FLUO-3/AM用DMSO配制，混匀后-20 ℃保存。 (2)凋亡的测定：按照Annexin-Ⅴ-FLUOS Staining KIT使用说明，取30 μl Annexin-Ⅴ染料加入到1.5 ml的结合缓冲液中，再加入30 μl PI染料，充分混匀。每个细胞样品中加入100 μl的混合染料，混匀，避光室温放置15 min。用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果判定Annexin-Ⅴ-／PI-为正常细胞，Annexin-Ⅴ+／PI-为凋亡细胞，Annexin-Ⅴ+ ／PI+ 为坏死细胞。每组样品取10 000个细胞，计算Annexin-Ⅴ+／PI-细胞数占总细胞数的百分比作为凋亡指数。 1.3 统计方法 数据以x-±s表示，应用SPSS11．5统计软件分析处理，并采用单因素方差检验(ANOVA)分析组间差异的显著性。若差异有统计学意义时，进一步进行两两比较(SNK法)，P 0．05表示两组间具有显著差异。 2 结 果 2.1 各组间再灌注15 min时CF和LDH比较 与control组相比，I/R组和DMSO+I/R组的CF显著降低(P 0.01)，LDH显著升高(P 0.01)；ALLN+I/R组与I/R组比CF显著升高(P 0.01)，LDH显著降低(P 0.01)，与control组