钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建论文.docVIP

　　钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建论文 .freelin）免疫小鼠，取脾脏，分离淋巴细胞，提取mRNA，逆转录成cDNA第一链，用简并引物经PCR分别扩增轻、重链抗体库，经重叠延伸PCR由Linker将轻、重链拼接成ScFv（单链抗体），用RS引物以ScFv为模板进行第2次PCR.freelent variable）antibody library by phage display.METHODS Mice munized by OUA-OVA（ouabain-ovalbumin）.mRNA the spleen lymphocyte and reversely transcripted.The heavy-chain and kappa light-chain variable region genes（VH and VL ）repertoirs of im-munoglobin plified individually and assembled into ScFv by a linker plified er，meantime SfiI and NotI restric-tion sites id pCANTAB5E and introduced into E.coli TG1by electropo-ration.Phagemid-containing bacterial colonies munized ent bly，the ScFv ent after EcoRI and HindⅢdigestion.Trans-fection test indicated that the titer of the culture supernatant Ab的鼠源性而大大限制了其在临床上应用，由此相继出现了基因工程抗体和噬菌体抗体库技术.我们通过噬菌体展示技术制备钠泵抑制物（又称内源性哇巴因，endogenous ouabain，EO）单链抗体库，以期从中筛选到钠泵抑制物单链抗体. 1 材料和方法 1.1 材料 RNA及mRNA提取试剂盒分别为美国Gibco公司及美国Bio101公司产品.逆转录酶为Pharmacia公司产品.Taq DNA聚合酶为美国Promega公司产品;dNTP为Clontech公司产品.PCR引物为Pharmacia公司产品，其中①Heavy-chain primer1和2分别为VH 基因5’端和3’端引物，用来扩增鼠Ig VH 基因;②Light-chain primer mix为10种VL 基因引物的混合物，用来扩增鼠Ig VL 基因;③Linker primer mix:序列为（Gly4 Ser）3 ，该引物两端的各24个碱基分别与VH 和VL 基因的3’端和5’端相互补，从而可将VH 和VL 基因片段拼接成ScFv基因;④RS primer mix为带有SfiI位点的重链基因5’端引物和带有NotI位点的轻链基因3’端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段同时引入克隆位点.噬菌粒载体pCANTAB5E为Pharmacia公司产品.其中含有氨苄抗性基因（Ampr ），Plac启动子及M13噬菌体间隔区片段，用于克隆ScFv基因的SfiI，NotI克隆位点及E tag序列和瑚珀终止码TAG;⑤辅助噬菌体M13KO7为Pharmacia公司产品，带有突变型基因Ⅱ，质粒复制起点和卡那霉素抗性基因（Kanr ），在其辅助下可使前者产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒.细菌菌株TG1 为Pharmacia公司产品，用于ScFv噬菌体表面展示. 1.2 方法［1-5］ 6in）免疫小鼠，每隔4RNA.参照Pharmacia公司的逆转录系统产品说明书，以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下37℃1h合成cDNA第1条链.以逆转录合成的cDNA第1条链为模板，用通用引物进行全套VH 和VL 基因的扩增.纯化回收的VH ，VL 基因片段与Linker primer mix以相同或接近等摩尔浓度混合进行重叠延伸PCR反应，从而将全套VH ，VL 基因随机拼接成ScFv基因库.以RS primer为引物将拼接的ScFv扩增，同时在5’及3’端分别加上SfiI，NotI酶切位点.用SfiI和NotI消化ScFv，将全套ScFv基因片段与pCANTAB5E载体在T4DNA连接酶（5～7）U作用下进行连接.同时作载体自连和阳性插入（control insert）对照.用Bio Rad电转化仪将连接产物转化入TG1感受态细胞，37℃摇床1h后，取100μL涂于SOBAG（含有100mg L-1 氨苄青霉素和20g L-1 葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上，30℃培养24h.从生长良好的SOBAG平皿上