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线粒体活性影响综述 作者：杜林 李莲 单位：仲恺农业工程学院轻工食品学院 中山大学生命科学院 我们的初步研究表明，线粒体产生的活性氧和甲酸诱导的酵母细胞死亡关系密切［9］。因此，我们推测，降低酵母菌线粒体活性，抑制活性氧的产生，可以增强酿酒酵母对甲酸的抗性。仪器与设备恒温摇床(哈尔滨东明仪器HZQ－C);培养箱(Thermo);流式细胞仪(VantageSE，BDBiosci-ences)。酵母菌菌株、质粒及培养基酿酒酵母BY4741由美国Rochester大学的Da-vidGoldfarb教授惠赠。酿酒酵母W303－1a野生型菌株由中山大学微生物遗传实验室提供，W303－1a背景ATP酶4亚基基因缺失株由中山大学微生物遗传实验室构建。YPD液体培养基:2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%D－(+)－葡萄糖，分装后121℃高压灭菌20min。 酵母细胞的培养及甲酸处理后的酵母细胞存活率测定取对数期酿酒酵母细胞培养液0.5mL，接种至装于250mL三角瓶中的50mLYPD液体培养基中，置于30℃，200r/min往复式振荡培养箱培养细胞至对数期或稳定期，分别取1mL菌液于1mL离心管中，立即加入相应摩尔浓度的甲酸，30℃处理40min后，在YPD培养基上以标准平板计数法计数，每一稀释度涂3个平板，以3次独立的实验结果计算存活率。 细胞内活性氧爆发的流式细胞仪检测细胞质中活性氧检测:取5mLYPD加入试管中，接入50mu;L过夜培养的酵母菌液，摇床培养6h(30℃，200r/min)。吸取以DMSO为溶剂的10mmol/L双乙酸二氯荧光黄(dichlorofluoresceindiace-tate，DCFH-DA)溶液2mu;mol/L，使染色时DCFH-DA的工作浓度为20mu;mol/L，避光孵育15min，使DCFH-DA充分进入细胞。根据需要，迅速加入一定量的1mol/L甲酸，室温或培养箱恒温避光处理，根据实验要求，分别吸取100mu;L处理中的各样品菌液加入FACS管中，加入900mu;L冷藏的PBS，立即以流式细胞仪上样分析。所用氩离子激光器激光波长为488nm，在530nm检测激发出的荧光，以流式细胞仪FL－1通道进行检测。或加入PI后以FL－1和FL－2通道检测。超氧阴离子的检测:先以无菌DMSO配置10mmol/L的超氧化物阴离子荧光探针二氢溴化乙锭(Dihydroethidium，DHE)溶液，取0.5mu;L加于1mL菌液，使DHE的终浓度为5mu;mmol/L，30℃避光孵育15min，加入相应浓度甲酸避光处理，以流式细胞仪FL-2通道进行分析。激发光波长为535nm，发射光波长为610nm。 甲酸处理导致线粒体超氧阴离子的产生与自由基的扩散为了了解活性氧爆发时细胞内超氧阴离子及细胞质内过氧化氢等活性氧的水平，故使用活性氧荧光探针DCFH-DA和DHE同 时对甲酸处理时细胞中的活性氧进行检测。由图1可见，在用甲酸处理10min时，以荧光探针DCFH-DA和DHE依次检测到活性氧的产生。细胞内DHE阳性率超过DCFH-DA的阳性率，显示DHE氧化后的荧光先产生。这和两种荧光染料的特性有关，DHE可检测线粒体产生的超氧阴离子，DCFH-DA可反映细胞质中的活性氧水平。线粒体电子传递链障碍导致活性氧产生时，超氧阴离子首先产生。所以实验中首先检测到较多的细胞产生了超氧阴离子，而此时以DCFH-DA检测到的细胞质活性氧阳性的细胞却比超氧阴离子阳性的细胞少，说明细胞质内的活性氧是由线粒体内超氧阴离子扩散形成。 还原剂预处理对活性氧爆发及存活率的影响N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，是细胞内还原性谷胱甘肽的前体，因为能够快速穿过细胞膜，因此是一种细胞生物学研究中广泛使用的还原剂。NAC可在细胞内形成含巯基的代谢产物，促进GSH的合成，消除自由基。在用甲酸处理酵母细胞，使其细胞内活性氧爆发前我们先用NAC预处理细胞，使其细胞内NAC达到较高浓度以抑制活性氧的水平，检测抑制活性氧对细胞存活率的影响。由图2可见，和对照相比，2mmol/L的NAC预处理明显降低了死亡率，说明细胞内还原剂的增加，活性氧的抑制可降低甲酸处理后细胞的死亡率。有可能是由于NAC减少了活性氧，从而抑制了活性氧对酵母细胞的损伤。另外，使用PI染色后流式细胞仪分析细胞膜完整性的方法也证明NAC预处理可以降低甲酸处理后的酵母细胞死亡率。 酿酒酵母线粒体活性对甲酸处理下细胞存活率的影响在病理和生理条件下，通常线粒体都是活性氧的主要来源。线粒体电子传递链的障碍，往往导致活性氧的大量形成。而在不同遗传性状的酿酒酵母细胞中，或同一种细胞处在不同的生长条件下，其线粒体活性往往有很大差异［10］。因此我们对不同类