雷帕霉素抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞增生论文.docVIP

　　雷帕霉素抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞增生论文 尚明花 范昱 姚建 董维平 张政 黄一新 徐培桢 【摘要】 目的 免疫抑制剂雷帕霉素对血管紧张素Ⅱ诱导的脐静脉内皮细胞（HUVEC）抑制作用机制。方法 血管紧张素Ⅱ联合不同浓度雷帕霉素刺激体外培养的HUVEC，3H-胸腺嘧啶核苷掺入法和3H-亮氨酸掺入法测定瞎胞DNA和蛋白质合成，流式细胞术检测细胞周期变化，免疫印迹（ethods Cultured HUVEC ulated by AngⅡ alone or in bination ycin. The cell proliferation easured by 3H-thymidine incorporation and 3H-leucinne incorporation. Cell cycle etry. Expression of p70S6k ，ERK2， cyclinA， cyclinB1 and cyclinD1 ycin inhibited AngⅡ-induced increase in protein content and DNA synthesis ycin inhibited the expression of p70S6k and cyclinD1 ycin targeted p70S6k could have great potential in therapeutic intervention in the proliferation of vascular endothelial cells. 【Key ycin angiotensinⅡ signal transduction DNA synthesis vascular endothelial cell 血管紧张素Ⅱ不仅是一种肽类激素，具有多种生物学功能包括促进血管收缩，刺激醛固酮分泌和肾脏对钠重吸收，而且，血管紧张素Ⅱ对成纤维细胞、肾上腺皮质细胞、血管平滑肌细胞和心肌细胞等多种细胞发挥生长因子的作用［1，2］。它能诱导细胞增生导致组织结构重构，因此，阻断血管紧张素Ⅱ的生物学效应对预防潜在的病理生理事件的发生具有重要意义。 雷帕霉素是一种强效免疫抑制剂和抗肿瘤药物，它通过抑制哺乳类雷帕霉素靶分子（mTOR）抑制蛋白质合成和使细胞阻滞于G1期。mTOR是核糖体的合成、蛋白质的合成及细胞生长的关键调节因子，它通过抑制p70S6激酶的活化和4EBP1 磷酸化调控氨基酸和生长因子刺激的蛋白质翻译过程。近期的研究资料提示雷帕霉素在抑制血管内皮细胞增生中发挥重要作用［3］，然而，雷帕霉素抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞增生信号传导机制仍然不清。 Ras-p42/p44 MAPK及phosphatidylinositol 3-kinase-p70S6 kinase (PI3K-p70S6K)两条信号传导路径在细胞增生方面都扮演重要的角色，为了阐明雷帕霉素对血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞的影响，我们的实验研究雷帕霉素 和血管紧张素Ⅱ刺激人脐静脉内皮细胞后，细胞DNA和蛋白质合成以及促进合成增加的主要信号蛋白ERK2、p70S6K和细胞周期蛋白的。 1 实验方法 1.1 细胞培养 本实验采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株HUVEC（ACTT No CRL-1998）为研究对象，细胞生长于含10%新生牛血清的RPMI 1640 培养基中（GIBCO），含1%的青-链霉素，在5％CO2，37℃培养箱内孵育，雷帕霉素溶于DMSO（SIGMA）终浓度分别为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，细胞在无血清培养基孵育48h后，换无血清RPMI1640、AngⅡ 10-6M、AngⅡ 10-6M联合不同浓度雷帕霉素（1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml）继续孵育24h。 1.2 测定细胞的DNA和蛋白质合成 细胞接种于96孔板，不同浓度雷帕霉素（1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml）刺激30min后，加含AngⅡ 10-6M无血清培养基孵育24h，在收集细胞前12h，每孔加入1μCi/ml氚标胸腺嘧啶核苷或氚标亮氨酸(3H-TdR，3H-亮氨酸，北京原子高科核技术应用股份公司)，甲醇固定后10%三氯醋酸洗2次，每孔加0.1N NaOH及液态闪烁体（Amersham NBCS 104），用BECKMAN LS6500液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲（cpm）。 1.3 流式细胞术检测细胞周期 1×108细胞接种于25cm2培养瓶，分别用不同浓度rapamycin和AngⅡ 10-6M刺激细胞，PBS洗2次后，70%冰乙醇固定1h，加入含RNA酶（10μg/ml）和碘化丙啶（500μg/ml）的PB