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Sichuan Agricultural Uniersity Sichuan Agricultural Uniersity Sichuan Agricultural Uniersity 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因的克隆及其序列分析 指导老师：姜冬梅 学生姓名：刘永贵 所在班级：水教10—2班 Sichuan Agricultural Uniersity 目的 目 录 1 材料与方法 2 结果 3 结论 4 参考文献 5 致谢 6 Sichuan Agricultural Uniersity 1 目的 促性腺素受体（GtH-RⅡ）属于G蛋白偶联受体超家族，其与促性腺激素（GtHⅡ）结合后可促进卵母细胞的成熟以及在精子发生的最后几个时期起主要作用。 鱼类中GtHⅡ基因除了在性腺中有丰富的表达外，在非性腺组织中也有少量或微量表达；可是还没有人对齐口裂腹鱼垂体组织中GtH-RⅡ基因进行克隆及序列分析，因此通过完成本次试验，为进一步研究齐口裂腹鱼的繁殖调控机制提供了一些基础数据。 Sichuan Agricultural Uniersity 2 材料与方法 2.1 试验材料 　　齐口裂腹鱼平均体长为30-40cm； 平均体重为0.5-1.0kg。采集齐口裂腹鱼垂体组织样品，置于液氮中速冻，然后转移至-80℃超低温冰箱中保存备用。 2.2 引物设计与合成 根据NCBI上斑马鱼GtH-RⅡ的cDNA序列，选取保守区序列；上游引物为5′CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3′，下游引物为5′ACACATAGCATCCGCAAATCACGAG3′，委托华大基因科技有限公司进行特异性引物合成。 Sichuan Agricultural Uniersity 2.3 方法 Sichuan Agricultural Uniersity 3 结果 图1 齐口裂腹鱼垂体组织总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳图 图2 齐口裂腹鱼GtH-R Ⅱ基因PCR电泳检测图 3.1 总RNA提取结果 3.2 RT-PCR产物检测 Sichuan Agricultural Uniersity 3.3 GtH-RⅡ核酸序列比对 图3 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因cDNA部分编码核酸序列分析 齐口裂腹鱼 斑马鱼 鲤鱼 齐口裂腹鱼 斑马鱼 鲤鱼 齐口裂腹鱼 斑马鱼 鲤鱼 齐口裂腹鱼 斑马鱼 鲤鱼 齐口裂腹鱼 斑马鱼 鲤鱼 齐口裂腹鱼 斑马鱼 鲤鱼 齐口裂腹鱼 斑马鱼 鲤鱼 　 GtH-RⅡ基因编码核酸的测序结果与Genbank上斑马鱼序列进行相似性分析，相似性达93.0%，与鲤鱼的相似性为92.6%。 Sichuan Agricultural Uniersity 3.4 氨基酸相似性分析 　　 GtH-RⅡ基因编码氨基酸序列的测序结果与Genbank上斑马鱼的序列进行相似性分析，相似性达97%以上。 图4 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ氨基酸序列及序列分析 Sichuan Agricultural Uniersity 3.5 GtH-RⅡ氨基酸组成分析 亮氨酸（Leu）含量为最高，达到了16.45%，赖氨酸（Lys）含量最低，只有0.87%；其它具体的氨基酸组成类型及酸值见表1。 Amino Acid Single letter abbreviations Acid Number Mol% Amino Acid Single letter abbreviations Acid Number Mol% Ala A 18 7.79 Met M 6 2.60 Cys C 11 4.76 Asn N 4 1.73 Asp D 11 4.76 Pro P 6 2.60 Glu E 7 3.03 Gln Q 10 4.33 Phe F 11 4.76 Arg R 10 4.33 Gly G 15 6.49 Ser S 16 6.93 His H 6 2.60 Thr T 13 5.63 Ile I 20 8.66 Val V 16 6.93 Lys K 2 0.87 Trp W 4 1.73 Leu L 38 16.45 Tyr Y 7 3.03 表1 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因编码的氨基酸组成 图5 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因编码的氨基酸组成 Sichuan Agricultural Uniersity 3.6 GtH-RⅡ的氨基酸疏水性分析与抗原决定簇预测 GtH-R Ⅱ基因编码的氨