基因工程原理与技术-3.ppt

一、黏粒载体的特点 ①具有λ噬菌体的体外包装、高效感染等特性。当然黏粒载体本身不能在体外被包装，只有在克隆了合适长度的外源DNA片段，才能被包装成噬菌体颗粒，这是对重组子的正选择。 ②具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性。 ③黏粒载体的分子量较小，克隆容量大。按λ噬菌体包装限制(38~51kb)，黏粒载体的最大克隆容量为48kb(如pHS262)，最低为14kb(如pJC720)。 ④具有与同源序列的质粒进行重组的能力。 二、黏粒载体的构建 黏粒载体都是在通用的克隆质粒载体的基础上，引入cos序列以及其它一些序列构建而成的。如pHC79来源于pBR322，pJB8来源于pAT153。 此外，①引入两个cos位点，如c2XB，解决黏粒克隆存在的问题；②在多克隆位点两侧引入一对T3、T7噬菌体启动子，制备RNA 探针，用于鉴别黏粒文库中的重叠克隆。如pWE15、pWE16。 ③构建与常用的大肠杆菌质粒载体没有同源性序列的黏粒载体。如pcos1EMBL，与colE1之间缺乏同源性。④导入真核细胞病毒的复制起点及相关选择性标记，从而构建了大肠杆菌-真核细胞的穿梭载体。如pWE15、pWE16等。 三、黏粒克隆的基本程序、存在的问题及解决方案 黏粒克隆是指应用黏粒载体克隆大片段DNA的技术。 1、黏粒克隆的基本程序 2、黏粒克隆存在的问题及解决方案 ①在连接反应中，黏粒载体片段彼此首尾相连形成多聚体分子。解决方案：一是用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；二是使用Ish-Horowicz-Burke黏粒克隆方案(见下图)；三是使用Bates-Swift黏粒克隆方案(双cos序列的黏粒载体，见下图)。 ②在连接反应中，酶切的基因组DNA片段(特别是较小的DNA 片段)往往会出现两个或数个片段随机再连接，串联地插入到载体上，其连接顺序并不符合基因组中排列顺序。因此，DNA序列分析结果往往会出现错误。 解决方案是将局部消化产物通过凝胶电泳分级分离，获得长度为31~45kbDNA片段。 Ish-Horowicz-Burke黏粒克隆方案 Partial Sau3A digestion Phosphatase Partial Sau3A digestion, phosphatase BamHI SmaI Bates-Swift黏粒克隆方案 四、常用黏粒载体及应用 常用的黏粒载体：pJB8、c2XB、、pHC79、 pWE15、pWE16、 pcos1EMBL、Charomid系列等。 黏粒载体主要用于真核生物的基因组文库构建。由于其克隆容量大，可以减少基因组文库的克隆数，提高筛选时阳性克隆的检出率，大大地减少了工作量。 黏粒载体在以下两种情况下特别有优势： ①在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因； ②克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段。 第五节 其它载体 一、人工染色体 1、酵母人工染色体(YAC) ①酵母自主复制序列； ②酵母着丝粒； ③四膜虫端粒； ④酵母选择性标记(Trp1、Ura3、Sup4——抑制宿主细胞ade2的琥珀突变)。 克隆容量：100~2000kb SUP4 11.4 kb 3、多功能质粒载体 具有克隆、表达、测序、体外转录等多种功能，避免了重复操作。如pGEM系列质粒载体： 4、穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector) 穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。 如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物细胞穿梭质粒载体。 第二节 λ噬菌体载体 一、λ噬菌体载体的生物学特性 1、λ噬菌体的生活周期 2、λ噬菌体的基因组结构和功能 cos位点(cohesive-end site)：λDNA环化时其粘性末端形成的双链区段. 左侧区：A~J，约20kb 右侧区：N~R，约12kb 中间区：J~N，约18kb，为非必须区段 cI 基因控制溶源过程，阻遏溶菌周期所有基因的表达 3、λ噬菌体的DNA复制 裂解周期的早期：θ型双向复制，产生环状DNA分子； 裂解周期的晚期：σ型滚