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基因工程原理 Principle of Gene Engineering 杨红 1. 基因组文库的大小 ——是指文库中的克隆子数量。 1976年，Clark等提出估算克隆子数的公式。 N=ln（1-P）/ ln（1-f） N：基因组文库必需的克隆数目 P：文库中目的基因出现的概率（99%） f：插入片段大小于基因组大小的比值 例如上面例子： N=ln（1-0.99）/ ln（1-15/ 3×106）= 9×105个 与基因组大小成正比 与克隆的DNA片段大小成反比 与载体的容量有关： 某一生物如果用质粒作载体需要900万个克隆， 用λ噬菌体需要90万个克隆， 用cosmid作载体需要35万个克隆。 （1）制备基因组DNA并片段化 三、 cDNA基因文库的构建 从基因组分离基因难度大： 基因以单拷贝形式存在，占染色体DNA的10-5——10 –7； 真核染色体DNA大，难定位基因； 真核生物基因有内含子，在原核细胞表达时没有加工功能。 1. cDNA文库的概念 ——某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这个群体叫cDNA文库。 2. cDNA文库的构建 （1）分离细胞总RNA，并从总RNA中分离纯化出mRNA mRNA的纯化 Poly（A）RNA的分离 ——柱层析Oligo（dT） mRNA分级： 梯度离心，电泳， mRNA转译活性鉴定 ——无细胞体系（兔网织红细胞裂解物） ——蛙卵系统（非洲爪蟾卵母细胞系统） （3） 双链cDNA的合成 ② Oligo（dG）寡聚引物引导法合成双链DNA ③ PCR法 （4） 将合成的双链cDNA重组到质粒或噬菌体载体上，导入大肠杆菌增殖 ① 以质粒为载体构建cDNA文库： 重组子鉴定、文库扩增方便。克隆效率低。 ③ mRNA丰度与cDNA文库大小的关系 cDNA文库大小的理论估算： N：cDNA基因组文库必需的克隆数目 P：文库中目的基因出现的概率（99%） f：mRNA丰度与总mRNA比值 4. cDNA克隆的优越性 cDNA克隆适合RNA病毒的研究 cDNA文库的筛选比较简单易行 目的基因筛选的假阳性率低 可以克隆在细菌中表达的基因 用于mRNA的结构和功能的研究 将已知蛋白作为抗原，从cDNA表达文库中筛选。 cDNA应克隆在表达载体中 一般以融合形式表达目的基因 考虑cDNA表达的方向性 Western blotting方法 必须在特异性蛋白纯化后应用 某些基因的表达量很少，难以纯化 有些基因没有蛋白产物 不同发育阶段、不同环境下蛋白不同 遗传密码简并性导致正确探针的难度。 ——利用被克隆DNA片段与寄主细胞染色体DNA在功能上的同源互补性筛选目的基因。 例如：大肠杆菌His缺陷型寄主细胞，原因之一是吲哆甘油磷酸脱氢酶基因突变。利用这特点，筛选面包酵母吲哆甘油磷酸脱氢酶基因。 4. 利用PCR技术筛选基因文库 酵母双杂交技术研究蛋白质之间的相互作用是细胞内实验，即不需提纯蛋白便可研究蛋白的相互作用，消除了提纯过程引起的蛋白变性，因而研究的是有生物活性的蛋白与蛋白之间的相互作用，反映了体内的真实作用情况。 ● BD-X的自激活作用； ● 一些AD-Y融合蛋白中的Y可能结合BD或启动子附近序列或蛋白，并能激活转录； ● BD-X与AD-Y并非通过BD-X－Y-AD直接激活转录，而是通过第3种蛋白或多蛋白的复合体把X、Y募集到一起，然后激活转录； ● 非特异BD-X－Y-AD相互作用，因为有的蛋白表面具有成簇的疏水氨基酸或其它可引起X、Y非特异作用的结构； 二、利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因 三、利用差式分析法分离目的基因克隆 ——从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录成cDNA，与无目的基因表达的组织中提取的mRNA杂交形成cDNA-mRNA双链分子，通过层析去掉杂交分子后，留下的单链cDNA中含有目的基因。 假阳性产生的原因 PCR技术的基本原理： 1. 套式PCR技术(nested PCR) 巢式PCR（nested PCR），是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 2. 反向PCR技术(inverse PCR) 未知序列 已知序列 3. 锚定PCR (anchored PCR) RACE: rapid amplification of cDNA,是以mRN