二维电泳的样品制备.pptVIP

双向电泳的技术流程和样品制备;生物学问题的提出;蛋白质组研究的基本技术路线;蛋白质分析技术之蛋白质组学之 蛋白质组表达模式的鉴定技术 ;质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程 ;实验方法 完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）;体外 pmol;实验样品的制备原则 ;增加样品溶解性的手段;表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。SDS作用后不利于稳定IEF中的等电点，不宜存在于IEF的样品溶解液中；只有后两类表面活性剂是可用的，其中CHAPS和SB3-10最好。 常用浓度为在8M尿素溶液中含2~5%的CHAPS，但在含高浓度硫尿的溶液中其作用有限；SB3-10是一种含有长线性基团尾端的两性去污剂，其作用要强于CHAPS，但在尿素浓度大于5M时不溶解。 现在总结的两种IEF溶解液的配方是①5M尿素＋2M硫尿＋2%CHAPS＋2%SB3-10，适用于需要强烈表面活性剂的蛋白样品的溶解；和②7M尿素＋2M硫尿＋4%CHAPS，适用于需要高浓度变性剂的蛋白质样品的溶解。 ; 还原剂：变性剂和表面活性剂是用来变性蛋白、暴露和溶解其疏水区域的。为了让大多数蛋白完全展开，还有必要来还原二硫键。 常用的还原剂有具游离巯基的β－巯基乙醇（β－ME）和二硫苏糖醇（DTT）。但DTT是带电荷的物质（尤其在碱性条件下），在IEF时则迁移出pH梯度，导致一些蛋白（通常是易于通过二硫键在内部起作用的蛋白）的溶解性丢失。如果用不带电荷的三丁基膦（TBP）来代替DTT则效果更好，不但能增加蛋白的溶解性，而且有助于样品在2-DE过程中从第一相转移到第二相；另外TBP不带巯基，不需被烷基化，从而简化了IPG的平衡过程。 ;起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和去垢剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。 应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。;亚蛋白质组样品的制备;2、根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行顺序抽提，从而分离出具有不同溶解度范围的蛋白质组亚群。 一般分3个层次： 第一步用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 第二步是把未溶解的小片（pellet）用常规IEF样品液（8m尿素＋4%CHAPS＋DTT）溶解，这次抽提剩下的小片主要是富集的膜蛋白，约占整个样品的11%（W/W）； 第三步是用增强的蛋白溶解液5M尿素＋2M硫尿＋2%CHAPS＋2%SB3-10＋2MTBP作最后的抽提。 ;预分步收集;特殊样品的制备;碱性蛋白：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。 极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在常规Tris/glycine缓冲液中，样品和缓冲液中游离的dodelcyl sulfate ions将持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。 ;样品中DNA的去除;蛋白载样量;样品制备和一向电泳时应严格防止角蛋白的污染。;样品液的准备; IPG pH Range;Reagent;Reagent;IPG胶条的蛋白质大约载样量;IEF的基本条件;非变性2D：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性/SDS-2D：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。 非变性/还原/SDS-2D：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，