测序技术进展教程.ppt

成果：利用HeliScope测序仪，Quake博士本人的基因组报告发表在《Nature Biotechnology》上。他是继James Watson和Craig Venter之后第三位基因组测序的非匿名个体。经过4轮运行，他们产生了数十亿个序列读取，测序的覆盖度达28倍,覆盖了90%的人类参考基因组。序列读长24-70 bp,平均读长为32 bp,并鉴定出280万个SNP位点和752个拷贝数变异。这次测序花了4个星期的时间，试剂花费为48000美元。 Pacific Biosciences Pacific Biosciences公司致力于开发一种新的测序技术——单分子实时技术(single molecule real time,SMRT)。 这一单分子合成测序技术依赖于被称为零级波导(zero mode waveguide,ZMW)的纳米结构来实时观察DNA的聚合。 该结构在一片薄金属膜上刻出数以千计直径数十纳米的亚波长小孔.并将金属膜附着在透明的支持基质上.由于每个小孔的尺寸低于光的波长,所以当光线从透明一侧照射时无法透射.并且在每个小孔的底部形成指数衰减的消逝波,这样创造了一个很小体积的检测空间.每个小孔底部固定一个聚合酶分子. 激光在进入ZMW后迅速衰减，因此，只有底部30 nm被照亮，随后核苷酸涌入ZMW中，并在阵列表面扩散。当聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中，这个过程需要几毫秒，而单纯的扩散只需要几微秒。这种时间差使掺入的核苷酸产生了很高的信号强度，类似于脉冲信号。因此，ZMW有能力在荧光标记核苷酸的背景下检测单个掺入事件。 主要技术及现存问题： PacificBio的技术在高速测序、长序列产出和低成本方面有着巨大的潜力.但是,与其他单分子测序平台一样,实时检测单个分子对于提高原始数据准确率是一个挑战,并可能成为一个障碍.如前所述,可以通过对同一样品进行重置后进行多次测序来减少误读. Oxford Nanopore 设计一种基因工程蛋白质纳米孔.通过遗传工程改造, 构建一种将氨基化环糊精(Am-inocyclodextrin)配体共价连接到位于脂双层膜中的α-溶血蛋白内的生物纳米孔. 纳米孔中连接有一个核酸外切酶。当从DNA模板链上被陆续切割下来的核苷酸依次进入纳米孔时，就会与环糊精分子发生暂时的结合，从而干扰通过纳米孔的电流，每一个碱基都会有其特有的干扰电流产生。 优点：仪器构造简单，使用成本低廉，不需要对核苷酸进行标记，也不需要复杂的光学探测系统。同时因为它是直接检测每一个碱基的特征性电流，因而也能对发生过修饰的碱基进行测序，这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。 缺点：采用的是水解测序法，因此不能进行重复测序，从而无法达到一个满意的测序精确度。 G3优点：可以使数据产出量更高, 不再需要昂贵的DNA 簇扩增步骤，进一步了降低测序的成本（样本、仪器）。 挑战：对于光学信号的检测技术的提高；保证测序的准确性。 最直接方法之一就是将核苷酸(主要是碱基)的空间线性排列方式可视化.足够高的分辨率,区分4种碱基. 扫描隧道显微镜(STM) 原子力显微镜(AFM) 电子显微镜 非光学显微镜成像 ——直接测序 最近,日本大阪大学的研究小组发现,在一条拉长的DNA链上,利用扫描隧道显微镜的图像,根据独特的电子指纹,可以将鸟嘌呤与其他3种碱基区分开来。 另外一些团队一直积极地致力于使用原子力显微镜来记录将每个碱基紧密连接的环拉开所需力的大小,以区分不同的碱基。 而ZS Genetics公司致力于使用电子显微镜直接测序.为了解决天然DNA分子在电子显微镜下对比度不足的问题,他们在聚合酶合成新DNA链时加入更重的元素。在电子显微镜下观察就可以获得的更重的DNA并确定其序列. 目前,我国也启动了第三代测序技术的研究。2009年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所—浪潮基因组科学联合实验室”,利用各自的优势联合研发国产第三代测序仪,第一台样机预计2013年问世,届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外公司的现状。 测序技术的发展依赖于学科含量交叉增加并向微纳技术倾斜 测序费用与产量的发展变化 随着新的测序技术的出现,大规模测序的成本迅速下降,花费1 000美元测一个人的基因组的目标相信很快就可以实现。届时,对于遗传病的诊治将变得简单、快速,并能从基因组水平上指导个人的医疗和保健,从而进入个人化医疗的时代。 期待……… 感谢您的关注 它们基本都是在20 世纪90 年代末被开发出来, 在2005 年前后商业化。 探针的5’末端分别标记了不同颜色的荧光染料。探针3’端1～5位为随机碱基，可以是ATCG四种碱基中