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2013.03.25-3.26 ctck蛋白纯化+ctck小量诱导 2013.03.25-3.26 ctck蛋白纯化+ctck小量诱导 2. ctck小量诱导的KRX单克隆菌体来源于之前重新挑选的单克隆经甘油保菌处理后的菌体。 2013.03.25-3.26 ctck蛋白纯化+ctck小量诱导 实验讨论： 1.本次蛋白纯化后发现ctck结构域E1与E2条带之间相差无几，考虑是否由于蛋白跑胶上样量太多，E1孔槽里的蛋白跑到了E2中去，导致E2看上去非常的杂，后过柱处理。 2.Ctck结构域的小量诱导，从图片上来看，菌体是有表达融合蛋白，但多数蛋白经过超声后留在了沉淀中，考虑ctck蛋白可溶性不佳。 2013.03.26 WB 2013.03.26 WB 本次实验目的：因为上周丁老师做vwfc结构域蛋白的ELISA发现超声21次所得到的蛋白ELISA结果非常不好，故王老师要求将手头上vwfc（3.19和3.21）蛋白做一次WB，验证是否有效。 从WB实验结构上来看，3.19的vwfc（即超声21次）的蛋白无条带，故弃去此批次蛋白，3.21的vwfc蛋白可以接着做ELISA。 2013.03.27-03.28 Mature结构域蛋白纯化+ctck大量 2013.03.27-03.28 Mature结构域蛋白纯化+ctck大量 1.从跑胶结果上来看Tev酶剪切效果尚可，但E1和E2中杂蛋白非常明显，而目的蛋白的条带不明显，故弃去。 2.ctck结构域大量诱导结果显示蛋白可溶性可，本次大量诱导的条件为25℃，225rpm过夜。 2013.03.27-03.28 ctck结构域蛋白纯化 2013.03.27-03.28 ctck结构域蛋白纯化 2013.03.27-03.28 ctck结构域蛋白纯化 因一开始使用的胶因分离胶太短，经王老师检查后觉得胶的质量太差，故重新跑胶，跑胶的顺序为：L，低盐E2，高盐E2 ，250mM E2 ，过柱（3.26） E2 ，M。但跑胶结果无条带显示，可能蛋白降解比较严重。 2013.03.28-03.29 ctck结构域蛋白纯化 2013.03.28-03.29 ctck结构域蛋白纯化 2013.03.28-03.29 ctck结构域蛋白纯化 本次还将上次500mlctck菌体离心后的破碎菌体再次加入纯化液一起提取蛋白，但只跑了E2。 王老师的E2因还可见TEV酶残留，故再次加入2.5ul的HISLINK树脂结合后加入甘油保存，我的E2过柱后保存，500ml所得到的E2直接加甘油保存，待下周做WB验证。 2013.03.28-03.29 vwfc结构域蛋白纯化-DMJ 2013.03.28-03.29 ctck结构域WB 2013.03.28-03.29 ctck结构域WB 本次将60-90kd的固定杂蛋白也做了一次WB，也可见条带显示，与抗体特异性不高可能有关系，也可能与蛋白自身有关，故下周做一张整块胶的WB来进行验证。 * M loading Ctck A 菌体 Ctck B 菌体 Ctck A 上清 Ctck B 上清 Ctck A 沉淀 Ctck B 沉淀 Ctck E1 Ctck E2 融合蛋白 7ul Hislink量 20ul Tev酶量 20ml 洗涤量 45min 结合时间 2ml 悬液 Halo量 500mlctck菌体过柱后所得到的FT 菌体 M loading M S M S-Tev M FT M E1 M E2 Ctck 菌体 Ctck 上清 Ctck 沉淀 ：融合蛋白； ：目的蛋白； ：Halo蛋白； ：杂蛋白 45s-59s-85%Ampl（6次） 超声条件 6ul Hislink量 25ul Tev酶量 20ml 洗涤量 1h 结合时间 1ml 悬液 Halo量 重新诱导的菌体 菌体 M L 7 7 7 Hislink量 20 20 20 Tev酶量 20ml(250mMNacl) 50ml(中间2次500mMNacl) 20ml(低盐) 洗涤量 1h 1h 1h 结合时间 1ml 1ml 1ml Halo量 45s-59s-85%Ampl（6次） 45s-59s-85%Ampl（6次） 45s-59s-85%Ampl（6次） 超声条件 重新诱导的菌体(ST) 重新诱导的菌体(DMJ) 重新诱导的菌体(DMJ) 菌体 M L S S-tev FT E1 wwz E1 ST E2 wwz E2 ST E2 500 融合蛋白 Halo 蛋白 杂蛋白 目的蛋白 Tev酶 7ul 10ul Hislink量 20ul 30ul Tev酶量 20ml 3
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