L苯丙氨酸的生产概要1.ppt

代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 Diagram 一、 L-苯丙氨酸的简介 二、 L-苯丙氨酸的生产方法 三、 L-苯丙氨酸的体内代谢途径 四、 L-苯丙氨酸的代谢调控 五、展望 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 一、 L-苯丙氨酸的简介 L-苯丙氨酸是芳香族氨基酸，是人体八大必需氨基酸之一。常温下是白色结晶或结晶性粉末固体，有L-型、D-型两种消旋体和DL-型外消旋体，具有生物活性的是L-型光学异构体，即L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)。 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 L-苯丙氨酸的 应用 食品业：制成甜味剂 如阿斯巴甜；作为人 必需氨基酸制成保健 食品。 医药业：Phe是一些抗 癌药物甲酸溶肉痛素、 苯丙氨苄等的中间体； 将抗肿瘤药导入靶部位 的载体，或添加于复合 氨基酸输液。 化妆品业：L-Phe广泛 应用于洗发用品和护肤 用品，有滋润和美白皮 肤、亮泽，毛发的作用 。 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 二、L-苯丙氨酸的生产方法 化学合成法：收率低，副产物多 酶法：工艺路线短，生产能力 强；酶的稳定性差，成本高 微生物发酵法：成本较低、产物纯 度高，对环境的污染相对较小 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸 预苯酸 苯丙酮酸 分支酸 分支酸变位酶（限速反应） 预苯酸脱水酶（限速反应） DAHP合成酶（限速反应） 三、 L-苯丙氨酸的体内代谢途径 E.coli是最常应用的菌种。图为以葡萄糖作为E.coli生长的碳源时的由DAHP生产L-Phe的详细路径图 1、增强中心代谢途径代谢流： （1）加强基因aroF的超量表达： DAHP的合成酶DS控制的反应是该途径中的第一个限速反应。DS是基因aroF、aroG、aroH控制的同工酶。 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 四、 L-苯丙氨酸代谢调控 （2）增加PEP 的合成 磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的2个关键酶,在大肠杆菌中分别由ppsA和pckA基因编码.扩增ppsA,pckA基因，使这两个基因单独表达或串联表达，都能提高PEP的合成量，进而提高DAHP的合成量。 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 （3）改造PTS系统 野生型大肠杆菌体内PEP的消耗主要是磷酰基转移系统(PTS系统)，丙酮酸激酶(pykA／pykF编码)，PEP羧化酶(ppc基因编码)。此通过改造PTS系统减少PEP的消耗可提高L-Phe产量。 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 2、分支途径代谢调控： 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 在pheA、tyrB基因克隆、串联克隆和表达完成的基础上,将aroG基因和pheA、tyrB基因以aroG-pheA-tyrB的顺序三基因串联到表达载体进行表达,提高酶活，提高L-Phe的产量。 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 基因克隆及基因克隆流程图： 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 表：携带不同表达质粒的大肠杆菌的粗抽提物的酶比活增减倍数 苯丙氨酸生物合成途径关键基因的串联表达： 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 优化关键酶基因 pheA、aroF、 ppsA、 tktA的协同表达 pheA:编码分支酸变位酶和预苯酸合成酶。简写成A aroF:编码DHAP合成酶。简写成F ppsA：编码PEP合成酶。简写成P tktA：编码转酮酶。 简写成T. 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 pZE21：含有卡那霉素抗性基因的质粒；pZE12：含有氨苄林抗性基因的质粒；pZA31：含有氯霉素抗性基因的质粒 CA-AFPT为pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE12-AF的 简 写 CK-AFPT为 pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE21-AF的简写 。 3、解除反馈抑制 aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶( AroG)是苯丙氨酸合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制. 通过使用苯丙氨酸类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的筛选, 获得初步解除对苯丙氨酸的反馈抑制突变株。通过DNAshuffiing技术有效的对ar0G基因进行改组,积累并引入有益突变,实现分子的定向进化,解除AroG的苯丙氨酸反馈抑制。 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用 aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶是Phe合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变A