分子生物学实验报告.doc

本科学生综合性实验报告 ? 姓名 学号 学院 生命科学学院 专业、班级 应用生物教育 实验课程名称 分子生物学实验 教师及职称 倪娟（老师） 开课学期 2014 至 2015 学年 下 学期 云南师范大学教务处编印 实 验 室 睿智楼422实验室 实 验 时 间 星期三（7—8节） 实验序号及名称 实验二、哺乳动物组织基因组DNA提取 1、实验目的 （1）.掌握动物基因组DNA提取的操作方法。 （2）.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。 2、实验仪器及试剂 Ⅰ. Instruments High speed refrigerated centrifuge（高速冷冻离心机）、 Glass homogenizer（玻璃匀浆器）、 Electrophoresis System（电泳系统）、 Ultraviolet transilluminator（紫外透射仪）、Ultra cold storage freezer（超低温冰箱）、Autoclave（高压灭菌锅）、 Pipettes（微量加样器）、Electronic balance（电子天平）、Acidometer（酸度计） Ⅱ. Material Liver of mice Ⅲ. Reagents Tris、SDS、EDTA、 HCl、 NaOH 、 Sodium acetate (NaAc)、 Acetic acid (HAc)、 Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、 TE buffer 、Protease K、RNase A、Agarose、DNA molecular weight markers 、Boric acid、Sugar、Bromophenol blue、 Fluorescent dye (Gelview) 3、实验原理、实验流程、装置示意图 Ⅰ.实验原理： 本实验利用去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶K进行水解处理。 随后用酚︰氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。 为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。 本实验方法分离得到的染色体DNA长度为100-150kb，适用于构建基因组文库和Southern杂交分析。如果要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤。 Ⅱ.实验流程： 储备液的制备 破碎、酶解细胞（过夜） 抽提DNA 、乙醇沉淀纯化DNA 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 观察实验结果 Ⅲ. 装置示意图： 酚抽提除去蛋白质的示意图 Ⅳ. 核酸的分离纯化、测定及研究方法 一、 分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。 ① 保证核酸一级结构的完整性；② 排除其它分子的污染。 （二）核酸的纯度要求 ① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； ③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 （三）核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； ② 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行； ③ 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； ④ 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因