蛋白质的分离纯化与定性定量汇总.ppt

印迹法的基本原理 印迹（blotting）是生物大分子物质如核酸或蛋白质通过不同途径转移到固相载体上的过程。 与凝胶相比，固相载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。 转移后的固相载体经过试剂处理后，可与相应探针反应，然后用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，即可显示出谱带。 目前常用的印迹法有四种： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质 印迹法最常用的固体材料有硝酸纤维素（NC）膜和PVDF膜。 为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐温20等封闭载体上印迹以外的剩余吸附点（该过程称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附到载体上。 探针是用化学方法将能与待研究蛋白质结合的物质如抗体，与某些标示物如酶、同位素或荧光物质、半抗原等结合形成的复合物。 蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或AP酶）。 Western blotting原理图示 蛋白质印迹的用途 用于检测样品中是否有特定蛋白的存在，并进行半定量分析。 基本操作步骤 样品的制备 细胞裂解物的蛋白定量 细胞裂解物的SDS蛋白质的转移 目的蛋白的检测 免疫印迹技术的注意事项 不能绝对定量，只能相对定量 各样品的上样量必须相同 选择合适的胶浓度 正负电极要确认 充分封闭 驱除气泡 注意保护膜，不能干燥 其他常用的蛋白质相关技术 蛋白质纯度的判定：HPLC、SDS、质谱 蛋白质序列测定技术：Edman测序法、质谱 蛋白质的空间结构测定：X射线晶体衍射分析、核磁共振 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 优点 样品加样位置和体积不受限制； 分辨率高于其它类型电泳； 可测定pI值； 缺点 样品在pI区域易沉淀，为增加样品溶解度，可以在胶中加入尿素，但导致蛋白质失活； 样品前处理麻烦。 等电聚焦的优缺点 3. 双向电泳 将等电聚焦技术与SDS技术组合起来的新技术，是目前分离蛋白质混合物最强大的技术，也是蛋白质组学研究的重要技术。 基本步骤：第一相等电聚焦后，在等电聚焦的垂直的方向进行第二相SDS。 pH 3 - - - - - - 10 （1） IEF 等电聚焦电泳 （2） SDS（3） 染色脱色 考马斯亮蓝 银 染 可综合利用层析和电泳分离纯化蛋白质 蛋白质的浓缩 超滤法 使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。 常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。 冷冻干燥法 在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。 注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态（在－70℃冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。 吸收法 采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。 PEG、蔗糖、凝胶干粉等。 沉淀法 硫酸铵、PEG、有机溶剂沉淀； 免疫沉淀。 3. 蛋白质的含量测定 蛋白质的含量测定 目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总蛋白含量；目前没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量； 最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考马斯亮蓝）、BCA法、紫外分光光度法等。 1. Lowry法 1951年Lowry在Folin酚试剂法和双缩脲法的基础上建立 原理：第一步反应：在碱性溶液中蛋白与Cu2+反应形成紫红色的络合物； 第二步反应：酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合液）与蛋白质芳香族氨基酸反应呈深蓝色。 优点：同时分析多个样品，简便；灵敏度提高；避免酚试剂局限于色氨酸和酪氨酸所造成的蛋白质含量测定偏差。 缺点：要求溶液完全溶解透明；酚试剂在碱性溶液中稳定性差，导致测定误差；反应受多种物质干扰。 2. Bradford法 由Bradford等人于1976年建立。 基本原理：考马斯亮蓝G-250在一定条件下可与蛋白质结合，导致其颜色从红色变为蓝色，最大光吸收峰从465nm移至595nm，其吸收度与蛋白质浓度成正比。 目前绝大多数公司都提供基于此原理的蛋白质定量试剂盒。 优缺点 优点： 操作简便，配合酶标仪，可同时测定多个样品； 可测定低达25 ?g/ml的蛋白质样品； 对干扰剂不敏感； 缺点： 染料主要结合蛋白质的疏水区，因此不同组成的蛋白质与