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蛋白质分离纯化方法 电荷 电泳（净电荷、分子大小、形状） 区带电泳 聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 毛细管电泳 离子交换层析 等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。 层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。 吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。 特异亲和力：亲和层析 其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC） 蛋白质纯度的鉴定方法：采用物理化学方法如电泳、离心沉降、HPLC和溶解度分析等。纯的蛋白质电泳时，其电泳图谱只呈现一个条带或峰，离心时以单一的沉降速度移动；纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，即溶解度曲线只有一个折点，在折点以前直线斜率为1，在折点以后斜率为零；此外，N-末端分析也用于纯度鉴定（单体蛋白质而言）。 必须指出，采用任何单独的一种方法鉴定纯度只能作为蛋白质均一性的必要条件而非充分条件，即蛋白质往往在一种鉴定中表现为均一性，而在另一种鉴定中又表现为不均一性。 蛋白质含量测定与纯度鉴定： 测定蛋白质含量的常用方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法，标准测定方法） 、紫外吸收法、染料（考马斯亮蓝）结合法、胶体金法（带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质变蓝色，灵敏度最高） 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 蛋白质总结 第3章：氨基酸（重点） 氨基酸分类 氨基酸的酸碱性质 氨基酸的化学反应 氨基酸混合物的分离 知识点 氨基酸：是蛋白质的构件分子，具有酸碱性质、手性、聚 合能力、特定的侧链结构及多样的化学反应； 兼性离子：指氨基酸分子含有一个正电荷和一个负电荷的形式。在氨基酸晶体中或中性水溶液中以兼性离子形式存在； 等电点：指氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的pH。等电点与离子浓度无关，只决定于等电兼性离子两侧的pKa值； 氨基酸类别 非蛋白质氨基酸 蛋白质氨基酸 （20种） 酸性氨基酸 天冬氨酸 谷氨酸 碱性氨基酸 赖氨酸 组氨酸 精氨酸 中性氨基酸 极性氨基酸 非极性氨基 酸 丝氨酸 苏氨酸 半胱氨酸 酪氨酸 天冬酰氨 谷氨酰胺 甘氨酸 丙氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苯丙氨酸 甲硫氨酸 色氨酸 脯氨酸 颉氨酸 氨基酸的酸碱性质 根据酸碱质子理论，HA A- ＋ H+ 氨基酸是两性电解质，既是质子供体，又是质子受体。当氨 基酸完全质子化时，可看作是多元酸；COOH和NH3+可以发 生解离，用Ka表示它们的解离常数；在氨基酸溶液中，pH值 计算公式如下： pH=pKa＋lg（质子受体/质子供体） 当pH大于等电点时，氨基酸带净负电荷；当pH小于等电点时，氨基酸带净正电荷！在一定的pH范围内，氨基酸溶液的pH离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。 氨基酸的化学反应 α-氨基参加的反应 与亚硝酸反应（生成羟基氨基酸和氮气） 与酰化试剂反应（氨基被酰基化而被保护） 烃基化反应 DNFB反应（生成DNP-氨基酸） PITC反应（生成PTH-氨基酸） 形成西佛碱反应（与醛类化合物） 脱氨基反应 α-羧基参加的反应 成盐成酯 成酰氯（与二氯亚砜等） 脱羧基反应 叠氮反应（氨基酸酯与肼、亚硝酸） α-氨基与α-羧基共同参加反应 与茚三酮反应（氨与还原茚三酮发生作用生成紫色物质） 成肽反应 侧链R基参加的反应 酪氨酸酚羟基 组氨酸咪唑 精氨酸胍基 色氨酸吲哚基 半胱氨酸巯基 氨基酸的旋光性与光谱性质 氨基酸的旋光性： 氨基酸的构型（指α-碳）也以甘油醛为参考物，从蛋白质的酸水解或酶水解液中得到的都是L型，但D型氨基酸在自然界也存在；蛋白质用碱水解或有机合成氨基酸时，得到的都是无旋光性的DL-消旋物 氨基酸的光谱性质： 参与蛋白质组成的20多种氨基酸在可见光区没有光吸收，在红外区和远紫外区都有光吸收，但在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收； 氨基酸混合物的分析分离 分离方法 柱层析 纸层析（相对迁移率，非极性性质） 薄层层析 离子交换层析