大规模表达序列标签测定及分析.ppt

大规模表达序列标签(EST)测定及分析 中山大学生科院 主要内容 什么是 ESTs ？ Serial analysis of gene expression (SAGE) 技术流程 基因芯片或微阵列技术流程 几种大规模分析基因表达水平的方法的比较 ESTs数据的不足 EST技术流程 一、cDNA文库构建 cDNA文库的构建及其均一化扣除杂交处理 扣除杂交技术的发展 SSH的原理与基本过程 二、序列测定及数据分析 测序方向的选择 序列前处理 (pre-processing) 镶嵌克隆的识别 常用的拼接软件 Cluster的连接 UniGene TIGR Gene Index STACK Clean Short and Tight 基因注释及功能分类 后续分析 实例介绍 文库信息 序列质量处理 序列长度和质量分布 聚类和重叠群（Contig)分析 BLAST Search against human genome sequence(e=1e-5) 功能分类和注释 表达量比较实例 ◆ Unigene 结合有指导的和无指导的方法，而且在聚类过程中使用了不同水平的严格度，聚类的算法为megablast,数据库不产生一致性序列。 ◆ TIGR Gene Index用的是有严格的和有指导的聚类方法,聚类的算法为类似于BLAST和FASTA的FLAST， 该法得到的一致性序列较短，交替剪切得到的不同的基因属于不同的索引。 ◆ STACK 用不严格的和无指导的聚类方法，聚类的算法为d2_cluster,产生较长的一致性序列，同一索引中含有不同的剪切方法得到的基因。 TIGR-THC UniGene STACK Long and Loose 注释： ◆ 序列联配 Blastn， Blastx ◆ 蛋白质功能域搜索(二结构比对) Pfam Interpro 基因功能分类 ◆ 手工分类 大部分以Adams 95年的文章中的采用分类体系为标准。 【Adams. MD, et al. Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence. Nature. 1995 377(6547 Suppl):3-174 】 ◆ 计算机批量处理 利用标准基因词汇体系Gene Ontology，进行近似的分类。 (/) GO的组织结构：定向无环图（ directed acyclic graphs [DAGs]） 各大数据库中基因或基因产物与GO术语的对照 其它分类系统与GO的对照表 ◆ 比较基因组学分析 ◆ 基因表达谱分析 ◆ 新基因研究 ◆ 基因可变剪切分析 ◆ 实验验证 ? MicroArray ? GeneChip ? RTPCR ? Northen bloting 家猪脑组织EST分析 Newborn 115d Foetus 50d Early born 107d Foetus 50d Foetus 100d Foetus 50d adult Develop-mental phase Brain stem Cortex cerebrum Cerebellum Tissue fbs ebs fcc ecc fce ece cbe Library name 文库与序列质量检验 聚类和重叠群分析 ORF的寻找 功能分类和注释 表达谱分析 交替剪接分析 分析过程 序列长度和质量处理 序列长度：无统一标准，一般认为100bp以上的 EST即可代表足够表达基因信息 ——污染序列去除，包括载体序列、细菌基因组序列(Crossmatch) ——重复序列的屏蔽（RepeatMasker) ——低质量区去除（Q20） ——扔掉100bp以下的序列 High-quality ESTs 46011, Avg. full length: 388.5 , Avg. quality: 35.9 per base 13459 5176 46011 Cap3 10763 5740 46011 Phrap singlets contigs 高质量序列 拼接软件 Based on phrap assembly Contig 大小分布 * 什么是EST? EST的应用 EST序列测定及分析过程 实例：家猪脑组织EST分析 ESTs的来源 上世纪80年代，对cDNA序列进行大规模测序的想法就曾提出，但对此一直存在争论，有人认为这种方法能发现成千上万的新基因；而反