新城疫抗体测定技术-2013.PPT

国标ND抗体测定技术 国标：新城疫诊断技术（GB/T 16525-2008） 2009-05-01实施 是开设畜牧兽医类专业学校学生的必会技能 是新城疫抗体监测和诊断的重要手段 是2011和2012年全国农业技能大赛的比赛项目，据 说还将是2014年全国农业技能大赛的比赛项目 仪器及材料 非免疫公鸡、 pH7.2生理盐水、 新城疫标准抗原、新城标准阳性血清、新城标准阴性血清、 3.8%的枸橼酸钠、96孔V型板、微量移液器、吸头、微型振荡器、温箱、离心机、天平、采血器等。 心脏或静脉采血2-3mL（不加抗凝剂），采血后使血液在 采血器或灭菌干净青霉素小瓶中凝固成斜面，室温下2-3 小时或4℃冰箱中过夜使血清析出，也可通过离心加快血 清析出。 血清为淡黄色透明液体。 翅静脉采血 针头在静脉血管一侧倾斜刺入皮肤，再与血管平行进针后刺入血管，见有少量回血即可采集血液，采血完成后马上用手压迫止血。 心脏采血 鸡右侧卧保定，上腿自然踡曲，在上腿膝关节稍前下方约1cm处（心脏搏动最明显的部位）垂直地面进针采血。 二、制备1％RBC悬液 1. 制备抗凝血 在采血器（注射器）中吸入抗凝剂（3.8%的枸橼酸钠，抗凝比例为1：10），心脏或静脉采血3-4mL，颠倒采血器使血液与抗凝剂充分混匀，然后将血液注 入离心管中，用天平配平。 2. 离心洗涤红细胞 （1）共洗涤3次，转速和时间均为：2000r/min、5min。 （2）第1次离心时间到，用移液器吸取并弃掉上清液、白细胞和血小板，加生理盐水，吹打混匀红细胞，配平后进行第2次离心，依此进行第3次离心。 （3）第3次离心时间到，吸取并弃掉上清液、白细胞和血小板后，读出离心管中红细胞的体积 。 注意：吹打混匀红细胞时不要太用力，以免破坏红细胞。 离心机的使用 离心机放置平稳 离心管对称放入离心机，使其处于平衡状态 按档位依次升高转速至所需速度。离心时间到，将转 速调为零，离心机停转后方可取出离心管。 3. 配制1%RBC悬液 根据红细胞的体积，计算所需生理盐水量，用所需生理盐水将红细胞泥全部冲入小烧杯中，摇匀即可。 注意：摇匀时动作要轻柔，以防红细胞破碎或液体外溢。 HA试验结果及规律 病毒的HA价（血凝滴度）：能使红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数称为病毒的血凝价，常用nlog2或1：xxx表示。 四、4单位病毒的配制 回归试验 用4V进行的HA试验（用4个孔），用于检验4V配 制是否正确。 4V配制正确的判定标准： 前2个孔完全凝集，后2个孔不完全凝集，如下图： 五、血凝抑制试验（HI） 当病毒与相应抗体结合后，病毒凝集红细胞的能力受到抑制，称为病毒的血凝抑制。 HI试验结果及规律 结果判定（新城疫抗体测定） 在生理盐水对照孔出现正确结果（红细胞完全流下）的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，正确判读被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清的HI效价，以nLog2方式报告结果，并填写结果报告单。 只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。 HI滴度可以作为强毒感染和免疫监测验重要依据。当HI滴度≥9log2或HI滴度明显高低不齐，可怀疑为新城疫强毒感染。 细节决定成败 不当之处，敬请批评指正 谢 谢 * 2013动物疫病检测新技术暑期培训 山东畜牧兽医职业学院 朱明恩 本技术依据中华人民共和国国家标准制定 安排本内容的原因 新城疫抗体测定基本操作规程 制备被检血清 制备1%RBC悬液 HA试验，测病毒的血凝价 配制4单位病毒 HI试验，测血清的抗体滴度 抗体滴度报告，以nlog2形式报告 一、制备被检血清 1．离心管、离心套管和管中液体作为一个整体进行配平 2．离心管中液体不能太满 配平注意事项 红细胞凝集（HA现象） RBC v v v v v RBC RBC RBC RBC RBC RBC 血凝性病毒 有相应受体的红细胞 RBC 血凝素纤突 受体 v 血凝素纤突 三、血凝试验（HA） 1．基本原理