分子生物学(基因组、转录组、蛋白组).pptVIP

Trp:色氨酸 b. MALDI-TOF (基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱) 4.3 蛋白质组研究的方法 A. 蛋白谱 用于鉴定蛋白组中的蛋白质，最多可以分析出50个氨基酸长度的多肽，因此一个蛋白质可以通过胰酶将其消化后进行测定。 一旦多肽片段被离子化，多肽的质量/电荷比就可以通过它在质谱仪中从电离源到检测器的“飞行时间”来确定。通过质荷比能够确认多肽片段的分子质量。 计算机中含有一个由所研究的物种基因组编码的每一个蛋白质经胰酶消化后各个片段的预计相对分子质量的数据库，计算机通过比较数据库与检测到的多肽片段的分子质量来确认最可能的初始蛋白质。 质量/电荷比 多肽通过来自激光的脉冲能量被电离化 柱腔 质量/电荷比 波谱数据 计算机通过比较数据库与检测到的多肽质量来确认最可能的初始蛋白质。 4.3 蛋白质组研究的方法 B. 蛋白质印迹法（Western杂交） Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。 其原理是：生物中含有一定量的目标蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目标蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。 4.3 蛋白质组研究的方法 B. 蛋白质印迹法（Western杂交） 然后加入特异性抗体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，或用同位素或生物素标记）的特异性反应进行检测。 根据检测结果，从而可得知被检生物细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。 Western blotting 电泳印迹 4.3 蛋白质组研究的方法 C. 鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质 通过鉴定有相互作用的成对或成组的蛋白质能够获得基因组活性相关的重要数据。 构建蛋白质相互作用图谱被视为是连接蛋白质组学与细胞生物化学过程的一个重要步骤。 4.3 蛋白质组研究的方法 C. 鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质 a. 噬菌体展示 该技术采用了一种基于?噬菌体或某种丝状噬菌体的独特的克隆载体。 待测基因被插入载体后，它的蛋白质产物能与噬菌体外壳蛋白以融合形式表达。 噬菌体外壳蛋白基因 插入要展示的蛋白质的DNA 制备一种展示噬菌体 融合可读框 使用噬菌体展示库来寻找与待测蛋白质相互作用的蛋白质的噬菌体。 把待测蛋白质固定在微量滴定盘的孔中 b. 酵母双杂交 4.3 蛋白质组研究的方法 C. 鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质 激活因子（转录因子）：一类控制基因表达的蛋白质，包含DNA结合结构域和转录激活结构域。 双杂交系统使用缺乏某一报告基因相应激活因子的酿酒酵母菌株，此时报告基因是不表达的。 转化酵母后产生融合蛋白 待测基因 一系列DNA片段混合物 使用酵母双杂交筛选相互作用的蛋白质 两套克隆混合，共转化酵母 4.3 蛋白质组研究的方法 D. 蛋白质相互作用图谱 也叫蛋白质相互作用网络，能展现一个蛋白质组中各成员间发生的相互作用。 酿酒酵母蛋白质相互作用图谱 （2001） 数据来自酵母双杂交试验 酿酒酵母蛋白质相互作用图谱 （2002） 数据来自酵母双杂交试验 The genome tells you what could be happened theoretically in the cell. Transcriptome tells you what might be happened. And the proteome tells you what is happening. Summary 本章学习要点 理解 Genomes, Transcriptomes 和 Proteomes三个名词，并阐明它们在基因组表达过程中是如何联系在一起的；理解基因由DNA（或RNA）组成的三个实验；掌握双螺旋结构的关键特征；正确区分编码RNA和功能性RNA；描述蛋白质结构的不同层次；描述遗传密码的关键特征；掌握转录组学和蛋白质组学的一般研究方法，特别是SAGE技术、微阵列和基因芯片技术以及鉴定蛋白质相互作用的技术（噬菌体展示、酵母双杂交等）。 * * * 3. RNA and the Transcriptome 基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。 转录组中的RNA分子以及其他来自非编码基因的RNA都由转录过程产生。 3.1 The structure of RNA 核糖 A, C, G, U 稳定性差