分子生物学 第11章 分子生物学研究方法.ppt

教学目的、要求 1. 掌握DNA克隆的一般步骤；用于DNA克隆酶的种类、特性及作用 2. 掌握受体细胞的种类、载体的特性 3. 掌握大肠杆菌载体质粒pBR322和pUC18/19 4. 掌握基因组文库和cDNA文库的概念；构建的步骤 5. 掌握核酸杂交的原理和步骤；探针标记的方法 6. 掌握DNA测序的原理 7. 掌握PCR的原理和反应过程 主要内容 第一节 DNA分子克隆概述 第二节 DNA分子克隆的四大要素 第三节 DNA的克隆 第四节 基因文库的构建 第五节 克隆基因的分离与鉴定 第一节 DNA分子克隆概述 一、基本概念 二、DNA克隆的基本过程 三、基因工程的诞生 四、基因工程的发展 一、基本概念 什么是基因工程 基因工程（Genetic Engineering）：在分子水平上，分离不同生物的遗传物质，在体外切割、重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA(基因)在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并稳定地遗传给下一代的技术。 DNA克隆(DNA clonging)的基本过程 基因的分离 DNA的体外重组(切、接) 重组DNA分子的转化和扩增(转、增) 转化子的筛选和鉴定(检) 外源基因的表达 第二节 DNA分子克隆的四大要素 一、分子克隆工具酶 二、分子克隆载体载体 三、目的基因 四、受体细胞 一、分子克隆工具酶 一般把DNA分子切割、 DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。 常用的工具酶： 1. 限制性核酸内切酶 2. 连接酶 3. DNA聚合酶 4. 其他分子克隆工具酶 1. 限制性核酸内切酶 (1) 定义：是一类识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3′-OH 基团5′-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 (2) 发现：本来是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细菌中的一种防御机制。 1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III。 限制性核酸内切酶的分类和命名 　 (4) II型限制性内切酶的基本特性 识别序列４～8个碱基，每４４（２５６）个碱基出现一个靶序列； 回文结构（palindrome） 三种不同的切口： 平末端(blunt end) ５’－突出粘性末端(5‘-cohensive end or stick ) ３’－突出粘性末端(3‘-cohensive end or stick ) II类限制－修饰系统是由限制内切酶和独立的甲基化酶组成的二元系统(限制修饰系统，R-M系统）。修饰与限制内切酶识别位点相重叠的序列。 GAA TTC CTT AAG (5) II型限制性内切酶的用途： DNA克隆 DNA杂交与序列分析 改建质粒 构建基因组图谱和文库 (2)DNA连接酶的种类 E. coli DNA ligase 催化双链DNA片段互补粘末端的连接(“粘接”) T4 DNA ligase 互补粘末端的连接 平末端的连接(“端接”) 平末端的连接 3、 DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大肠杆菌DNA聚合酶I 大片段（ Klenow ） T4-DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 耐热DNA聚合酶 4. 其他分子克隆工具酶 (1) 末端脱氧核苷酸转移酶 (2) T4多核苷酸激酶 (3) 碱性磷酸酶 (1) 末端脱氧核苷酸转移酶 常用：从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白质 催化作用：在二价阳离子存在下，催化dNTP加到DNA分子的3′-羟基端。 用途： 在平末端合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端 给载体或cDNA加上互补的同聚物尾巴，用于外源基因重组， 标记DNA片段的3′端 (2) T4多核苷酸激酶 来源：从T4噬菌体感染后的E.coli中提取的具有激酶活性的蛋白质 作用：催化ATP的?-磷酸基转移至DNA或RNA片段的5′末端 用途： 标记DNA片段的5′端，制备杂交探针 基因化学合成中，寡核苷酸片段5′磷酸化 用于测序引物的5′-磷酸标记 (3) 碱性磷酸酶 来源：大肠杆菌(bacterial alkaline phosphatase, BAP)和小牛肠(calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) 作用：脱磷酸化作用