第三章__载体.ppt

基因工程工具酶比较 DNA聚合酶：在DNA复制时起作用，将多个脱氧核苷酸催化聚合为脱氧核苷酸链（也就是DNA单链），此时形成的化学键是磷酸二酯键。 DNA解旋酶：在DNA复制或转录时起作用，将DNA的双链解开，作用对象是氢键，使氢键断裂 DNA水解酶：在消化道或细胞内起作用，将DNA水解为脱氧核苷酸，作用对象是磷酸二酯键 基因工程工具酶比较 DNA连接酶：在DNA修饰过程或基因工程中起作用，将两个DNA片段连接起来，此时形成的化学键是磷酸二酯键。 基因工程工具酶比较 限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。 基因工程工具酶比较 DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 他们的区别在于，聚合酶是把单个脱氧核糖核苷酸连起来。也就是用于DNA复制。连接酶是把断裂的DNA再缝合起来。一般就是限制酶切开的它在连起来。 基因工程工具酶比较 RNA聚合酶（又称RNA复制酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。真核生物RNA聚合酶：真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。 反转录酶：RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。在基因工程中起作用。 基因工程工具酶比较 解旋酶：是一类解开氢键的酶，由水解ATP来供给能量它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。在细菌中类似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性。大部分的移动方向是5‘→3’，但也有3‘→5’移到的情况，如n‘蛋白在φχ174以正链为模板合成复制形的过程中，就是按3’→5‘移动。在DNA复制中起做用。 DNA限制酶作用于磷酸二酯键 DNA连接酶作用于磷酸二酯键DNA聚合酶作用于磷酸二酯键DNA解旋酶作用于氢键 基因工程工具酶比较 核糖核酸酶A：又称为RNA酶，主要是降解磷酸二酯键 ，可以用于去除DNA：RNA或RNA：RNA杂合体中未杂合的RNA区域；降解DNA制备物种的RNA分子；确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。 脱氧核糖核酸酶：一种发现于多种细胞和组织的核酸酶，属核酸内切酶，靶向切割邻近嘧啶的磷酸二酯键，产生5’端为磷酸基团、3’端为羟基的多聚核苷酸，平均消化产物最小为多聚四核苷酸。 利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌中进行表达,该质粒载体应具备哪些元件? 1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。 4、TA克隆载体 原理：Taq酶特点 研制出了一种线形质粒，其3 ’端各带一个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体被称为TA克隆载体。 环化的质粒克隆载体  TA克隆载体姜颖等人于2000年提出了一般质粒克隆载体改造成TA克隆载体的方法。 Sup4 基因编码赭色抑制tRNATYR(酪氨酸)，抑制赭色表型 (成为白色)。不含外源DNA片段的YAC载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。插入的外源DNA片段的YAC重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。 表达载体的必备条