Pus186-CotC-Ta18重组枯草芽孢工程菌免疫应答特征分析研究.pdfVIP

贵阳医学院2014 届硕士研究生论文 Pus186-CotC-Ta18 重组枯草芽孢工程菌免疫应答特征分析研究 专业：病原生物学 研究生： 沈 晨 导师：黄 江 教授 【摘要】目的分析课题组已构建成功的亚洲带绦虫六钩蚴Ta18 抗原重组 枯草芽孢工程菌（Pus186-CotC-Ta18）的免疫应答特征，为阐明亚洲带绦虫六钩 蚴Ta18 抗原生物学功能和免疫保护的分子机制奠定基础。方法 使用DSM(Difco Sporulation Medium)培养基诱导Pus186-CotC-Ta18 重组枯草芽孢工程芽孢生成， 收集芽孢，用 1MNaCl 洗涤芽孢，加PMSF 至终浓度 1 μmol/L，将芽孢溶于一定 量蒸馏水中，68°C 1h 杀灭残留的枯草杆菌繁殖体。芽孢于-20°C 保存备用； 提取芽孢外壳蛋白，使用Ta 18 抗血清，蛋白印迹验证外源蛋白在重组芽孢表面 的表达；使用Ta18 抗原重组枯草芽孢口服及腹腔注射免疫大鼠：①腹腔注射免 疫：30 只SD 大鼠，随机分为3 组，分别为对照组（naive），Pus186-CotC 芽孢 组（cotc）和Pus186-CotC-Ta18 表达芽孢组（cotc-ta18），每组10 只,拟分别 腹腔注射生理盐水、1 10 ×10 pus186-CotC 芽孢和pus186-CotC- Ta18 表达株芽孢。 30 只大鼠均取尾血后，分离血清，标记并分装冻存，每组予以第1 次腹腔注射。 间隔两周免疫一次，共3 次，分别于第1、15、32、50 天，各组取尾血，分离血 清，标记并分装冻存；②口服免疫：选3 组SD 大鼠，每组10 只。分别为对照组， 芽孢组，表达株芽孢组。对照组（naive），Pus186-CotC 芽孢组（cotc）和 Pus186-CotC-Ta18 表达芽孢组（cotc-ta18）分别进行口服灌胃生理盐水，1× 10 10 pus186-CotC 芽孢和pus186-CotC- Ta18 表达株芽孢，在第0、1、2、16、17、 18、33、34、35 天用灌胃针经口免疫各组大鼠，分别在第 1、15、32、50 天采 集血清样本，用于ELISA 检测。设Pus186-CotC-Ta18 芽孢组、Pus186-CotC 芽 孢组及常规感染组，口服免疫家猪，定期收集血清和粪便，ELISA 法检测血清中 IgG 及粪便中 IgA 的含量变化。结果 目的基因在芽孢表面高效表达，被重组蛋 白Ta 18 免疫的 SD 大鼠血清，具有免疫原性。重组Ta18 枯草芽孢杆菌免疫组 的大鼠血清细胞因子 IFN- γ、IgG 明显升高，且腹腔注射组峰值在第15 天后出 现，早于口服免疫组，体液免疫应答中 IgG亚类 IgG1 升高(P0.05)，并伴有细 胞因子 IL-12 的分泌(P0.05)，IgG2a 的升高（P0.05）。各组的 IL-4 水平差 贵阳医学院2014 届硕士研究生论文 异无统计学意义（P0.05）。家猪粪便中特异性 IgA水平显著高于非重组芽孢处 理组及常规感染组，但血清 IgG升高不明显。 结论 对已经成功克隆表达的Ta18 抗原重组枯草芽孢进行了诱导表达，证实Ta18 在重组芽孢表达。重组枯草芽孢对各组免疫大鼠，血清特异性 IgG、IgG1和 IgG2a 水平高于对照组；细胞因子 IFN- γ、IL-12 均升高（P0.05）。重组枯草芽孢能 发挥免疫佐剂作用，活化家猪肠粘膜上的相关淋巴组织，使SIgA 抗体分泌增强。 重组Ta18 枯草芽孢杆菌能有效的诱导机体产生免疫应答，包括细胞免疫及体液 免疫，为新型抗感染饲料添加剂的研制提供了理论基础。 【关键词】亚洲带绦虫；Ta 18；免疫学特性；枯草杆菌； 贵阳医学院2014 届硕士研究生论文 前 言 猪带绦虫（Taenia solium）、牛带绦虫（Taenia saginata）和亚洲带绦虫 （Taenia asiatica）是常见的人兽共患寄生虫，人是这三种带绦虫唯一的终宿 主，猪和牛是其主要的中间宿主，猪带绦虫感染人也可引起后果严重的囊尾蚴病 [1-3] 。随着全球范围内移民的增加，人体带绦虫不仅流行于较多