仕必纯应用笔记第五期.pdfVIP

1. 使用串联切向流过滤高效浓缩慢病毒载体 2. 中空纤维切向流过滤结合膜层析制备高纯度HSV-2 候选疫苗ACAM529 3. 平衡透析：土壤颗粒对磺胺药物分子的pH 依赖性吸附 4. 体内微透析：评估补骨脂素醇质体在大鼠体内的局部递送 目录 5. 中空纤维测试法：抗肿瘤药物筛选 使用串联切向流过滤高效浓缩慢病毒载体 简介 超速离心是病毒颗粒浓缩的常用方法之一，但其 VSV-G-假型自我灭活慢病毒载体是不可或缺的 浓缩系数较低，每次处理量也偏小，且繁琐的多 生物实验工具之一，与之前的 γ-逆转录病毒载体 步操作会降低病毒颗粒回收率。离心过滤是相对 不同的是，慢病毒载体可转导非分裂细胞，并可 较简单的浓缩方法，但过滤器本身会捕获截留大 携带更多的转基因盒，在细胞中的转基因表达时 量载体，造成损耗。相较而言，切向流过滤（TFF） 间也更长，即可获得更高的滴度，而其遗传毒性 操作简单，损耗低，且可通过洗滤过程有效降低 相对较低。 产毒细胞代谢物及分泌蛋白，但传统的一步式TFF 浓缩程度仅可达50- 100 倍，本实验使用两步TFF ， 一般情况下产毒细胞上清液中的载体滴度足以转 成功将 5.5L 慢病毒载体原液浓缩至 1mL 左右， 导常规细胞系，但原代细胞较难转导，需要进行 且回收率高达 97%以上。而对终产物的质量分析 载体浓缩以获得较高浓度。此外，一些载体因整 显示，浓缩的慢病毒载体可有效转导原代人 合了会降低滴度的遗传元件，且大多数细胞类型 CD34+造血干/祖细胞和原代人纤维母细胞，且无 也不耐受产毒细胞生长培养基或其分泌蛋白，所 明显毒性。 以浓缩及清洗是慢病毒载体使用的必要步骤。 1 Spectrum Laboratories, Inc. Advancing the Science of Separation! 实验 过程中，监测入口压力，并维持为6psi 以下。第 一步操作可将5.5L 料液浓缩至50mL ，即浓缩100 实验使用含pCCL 载体质粒、gag/pol 表达质粒 倍左右。浓缩的载体再用 1000mL 含胎牛血清的 及囊膜表达质粒pMD.G （VSV-G）的转染混合液 洗滤缓冲液进行恒量洗滤。之后，将系统流路更 转染293T 细胞，并于转染后进行丁酸钠诱导，培 换为 FP2 ，通过完整性测试后，将第一步获得的 养一定时间后，分两次回收含 LV 培养基，过 50mL 浓缩液进一步浓缩至 1mL ，即总浓缩达 0.8μm 过滤器，滤液保存于无菌容器。 5000 倍。该步入口压力维持为9psi 以下。 切向流过滤使用仕必纯 KrosFlo 研发用 IIi 切向流 随后，通过 HT-29 细胞载体转导实验确认滴度， 过滤系统（产品编号：SYR