编号：农业微生物研究中心[菌种-130531], 共6页 承担单位：福建省农科 .docVIP

编号：生物[菌种-130531], 共页 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：脂肪酸提取方法对芽胞杆菌属种类的脂肪酸测定影响 试验人员：刘国红 试验负责：刘波 报告日期：2013-05-31 计数月份：2013年05月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 05911．试验目的细菌脂肪酸提取步骤主要为皂化和甲基化，因此皂化试剂量、皂化时间以及甲基化试剂量对脂肪酸提取效果有较大的影响，本节试验比较这3个因素对测定准确度的影响。 2．试验方法.1.1 供试菌株 球形芽胞杆菌Bacillus sphaericus FJAT-9。 .1.2 主要试剂和仪器 皂化试剂（试剂I）：150 mL去离子水和150 mL甲醇混匀合，加入45 g NaOH，同时搅拌至完全溶解；甲基化试剂（试剂II）：325 mL 6 mol L-1的盐酸加入到275 mL甲醇中，混合均匀；萃取试剂（试剂III）：加200 mL甲基叔丁基醚到200 mL正己烷中，混合均匀；洗涤试剂（试剂IV）：在900 mL去离子水中加入10.8 g NaOH，搅拌至完全溶解；饱和NaCI溶液：在100 mL去离子水中加入40 g NaCI。以上所有有机试剂均为色谱（HPLC）级，购于Sigma公司，无机试剂均为优级纯。安捷伦7890 N型气相色谱、Sherlock MIS、振荡器、水浴锅、10 mL带盖试管、玻璃量筒等。所有的玻璃器皿均须烘干后使用。 .1.3 培养基 TSBA培养基：胰蛋白脉大豆肉汤（TSB）30 g、15 g琼脂和1 L去离子水，其中TSB购于BD公司。 试验方法 .2.1 脂肪酸的提取方法 所有供试菌株均在TSBA培养基上培养。菌株的培养和脂肪酸的提取参照文献描述（Sasser，1990）的方法。新鲜培养的待测菌株按四区划线接种至新鲜的TSBA培养基，28 培养24 h。在第三区刮取40 mg菌体，置于试管，加入试剂I，沸水浴5 min，振荡5-10 s，然后接着沸水浴。冷却至室温后加入试剂II，混匀后80 水浴10 min。迅速冷却，加入1.25 mL试剂III。振荡10 min，吸弃下层溶液。然后中加入3 mL试剂IV及几滴饱和NaCl溶液，振荡5 min。静止，待溶液分层后，吸取上层液体于GC样品管中待测。 皂化时间的优化：以标准时间25 min为基点，左右各取两个值，分别为10、20、25、30和35 min，其他步骤与与文献描述一致。 皂化试剂量的优化：以标准试剂量1.0 mL为基点进行设计，分别为0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL，皂化时间以已优化好的为标准，其他步骤与文献描述一致。 甲基化试剂量的优化：以标准试剂量2.0 mL为基点进行设计，分别为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL，皂化时间和皂化试剂量以已优化好的为标准，其他步骤与文献描述一致。 .2.2 脂肪酸的检测分析 细菌脂肪酸成分检测采用微生物鉴定系统进行分析（美国MIDI公司产品），该系统包括了Agilent 7890 N型气相色谱系统，Sherlock MIS 6.0处理软件。色谱分析柱温采用二阶顺序升温法，即第一阶段170 起始，每分钟升温5 ，升至260 ，第二阶段再每分钟升温40 ，升至310 ，维持90 s；汽化室温度250 、检测器温度300 ；载气为氢气（2 mL.min-1）、尾吹气为氮气（30 mL.min-1）；柱前压68.95 Kpa；进样量1 μL，进样分流比100:1。 .2.3 脂肪酸的数据分析 利用林营志等（2009）编写的程序，将Sherlock MIS6.0检测出的芽胞杆菌属每个种的脂肪酸检测数据转换成以芽胞杆菌为样本，以脂肪酸生物标记为指标的数据矩阵Excel文件。然后利用生物统计软件SPSS 16.0进行统计分析，脂肪酸树状图采用欧式距离进行构建。脂肪酸含量分布图采用Excel进行分析。 3．试验结果皂化时间对芽胞杆菌脂肪酸鉴定结果的影响 皂化时间对球形芽胞杆菌的脂肪酸鉴定影响统计见表 1。由表 1可以看出，球形芽胞杆菌的鉴定结果准确率非常高，第一匹配值和第二匹配值都为球形芽胞杆菌，除皂化时间为10 min的重复I和35 min的重复I之外，其他鉴定指数均都在0.5-0.8之间。 由图 1可以看出，皂化时间对球形芽胞