第三章：酶的分离纯化.ppt

1 不连续凝胶电泳 分成三层：样品胶、浓缩胶、分离胶。特别适用于稀溶液的分离。 - + 样品胶 浓缩胶 分离胶 2、SDS-凝胶电泳 制备凝胶时加入1~2%的十二烷基硫酸钠，制成SDS-凝胶。 3.6.2 等电聚焦电泳 在电泳系统中加入两性电解质载体,通电后在电场中形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。待分离组分在电场作用下移动到与其等电点相当的pH位置上，使不同等电点的物质分离。 特点 分辨率高：可分开等电点相差0.01~0.02pH的蛋白质。 克服了电泳的扩散作用：时间越长区带越窄。 与点样位置关系不大：不论点在何处都可以聚焦到等电点位置。 重现性好 可分离很稀的样品 可准确测定蛋白质或多肽的等电点。 对等电点处不溶解或发生变性的蛋白质不适用 载体两性电解质要求p107 在等电点状态下有足够的缓冲能力，以便控制好pH梯度。 在等电点状态下有足够的导电能力，以便使一定的电流通过。而且要求各个等电点不同的两性电解质有相同的导电系数，使整个体系导电均匀。 比待分离组分的分子量小，以便在等电聚焦后易于分离。 化学组分与待分离组分不同，且与样品中各组分不相互作用 。 等电聚焦电泳槽 3.6.3 毛细管电泳 主要优点 分析条件选择简便及分离的高效性。当改变2或3个数据时,(例如缓冲剂的pH值,或浓度值)可以在很大程度上提高分离的效率和选择性。在强电场的作用下,毛细管内液体分离的效率可达到2,000,000理论的塔板数(同液相色谱法相比,色谱柱的分离不超过60,000-100,000理论的塔板数)。 可靠性.由于此方法不使用固体物质,排除了毛细管老化的可能性,同时不与样品发生任何物理化学反应,从而避免了毛细管的经常性损耗,降低了毛细管电泳仪的成本。 时间短,价格低廉。毛细电泳的高效分离,使样品的准备工作降到最低程度,节省了试剂的消耗。同时,由于在毛细管中直接进行检测,致使分析时间缩短为10-15分钟。 3.7 　酶的结晶 结晶是溶质以晶体的形式从溶液中解析出的过程. 结晶意义:可以提高纯度,获得较高纯度的酶 ;同时有些物理性质的研究需要结晶的酶。如X射线晶体衍射测结构。 结晶条件：通常要求酶的纯度足够，且不同的酶对纯度的要求不一样；酶的浓度合适，太低不产生结晶、太高晶体小不易长大。还要控制好温度、pH、离子强度等。 常用的结晶方法： 盐析结晶法：加盐降低溶解度 有机溶剂结晶法：加有机溶剂，含盐少，时间短，但要注意防止变性。 透析平衡结晶法 改变溶解度 等电点结晶法: 调节pH达到PI,注意防止局布过酸或碱常配合透析平衡、扩散法。 温度差法结晶 金属离子复合结晶法 透析平衡法 3.8　浓缩与干燥 一．浓缩 从低浓度酶液中去除部分水或其它有机溶剂而成为高浓度溶液的过程。为防止酶变性失活要求低温或快速，常用的有真空蒸发器(低温）和薄膜蒸发器。(快速） 真空蒸发器 优点是低温，酶不易失活 薄膜蒸发器 该蒸发器具有生产能力大、效率高、物料受热时间短等特点 该蒸发器具有生产能力大、效率高、物料受热时间短等特点 二．干燥 :获得含水少的固体 干燥后的固体提高了产品的稳定性，易于保存、运输和使用。 真空干燥 冷冻干燥:成本高适合热敏物质。 喷雾干燥:接触时间短、快速 气流干燥:设备简单、操作方便，易失活 吸附干燥:使用干燥剂 第三章：酶的分离纯化 酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度。 要点： 酶主要还是蛋白质，能用于蛋白质的分离纯化方法通常可用于酶。 要尽量减少酶活损失。 要分清是胞内酶还是胞外酶 根据酶的用途采用不同的方法 3.1 酶分离纯化流程 酶原液 否 胞内酶 细胞破碎 提取 分离 浓缩 干燥 预处理 细胞分离 3.2 酶纯度的评价 总活力的回收率 比活力提高的倍数 酶的纯度 实用价值 ＜－－侧重科研 3.2.1 酶总活力回收率与提纯倍数 1 总活力的回收率：反映提纯过程酶活力的损失情况。 总活力的回收率＝纯化后总活力/纯化前总活力*100% 2 提纯倍数：反映纯化方法的效率 纯化倍数＝纯化后的比活/纯化前的比活 示例： 腺苷酸激酶纯化表（6kg猪肉） 纯化步骤 总体积 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 抽提 16600 43500 0.0413 0.95 1 100 ml mg katal katal/kg % 调pH 15700 11200 3.25 层析 1380 1716 13.02 凝胶过滤 211 462 43.17