荧光法和液相色谱-质谱联用法测定司莫司汀导致λDNA交联率的比较研究.pdfVIP

第39卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第4期 2011年4月 ChineseJournalof 476～480 AnalyticalChemistry 荧光法和液相色谱一质谱联用法测定司莫司汀导致 九DNA交联率的比较研究 赵丽娇’ 任婷 白宝清 张然 钟儒刚 (北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124) 摘 要 司莫司汀是重要的抗癌烷化剂，其抗癌机制与导致DNA股间交联有关。使用荧光法和高效液相色 谱一电喷雾串联质谱联用(HPLC-ESI-MS／MS)法对司莫司汀导致的kDNA交联率进行了测定。结果表明：药物 浓度为2，4’8和16 较，荧光法测得的是交联DNA双链的含量，而HPLC-ESI—MS／MS法测得的是实际交联碱基对的个数，后者更 能从本质上揭示交联率的变化规律。两种方法均表明交联反应初期存在一段交联率上升缓慢的“诱导期”，这 为阐明交联机理提供了依据。 关键词氯乙基亚硝基脲；DNA股间交联；荧光；高效液相色谱一电喷雾串联质谱；司莫司汀 引 言 氯乙基亚硝基脲(CENUs)是重要的抗癌烷化剂，主要用于脑瘤、恶性淋巴瘤及黑色素瘤等的治疗。 基对含量越高生成交联越多。Penketh等“21用T7 对于评价亚硝基脲类抗癌药物的活性具有重要意义。本研究采用荧光法和高效液相色谱一电喷雾串联质 谱法对司莫司汀作用于},DNA生成的dG-dC交联进行了定量分析，并比较了两种方法测得的交联率。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 TSQ 量PCR仪(美国Stratagene公司)；Eppendorf Microcon 甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、无水乙醇及其它酸、碱、盐等均为国产分析纯试剂。 2．2实验方法 2．2．1实时荧光法检测交联率在250XDNA溶液中分别加入2、4、8和16mmol／L的司莫司汀， mg／L 2010-08-09收稿；2010-10-20接受 *E-mail：zhaolijiao@bjut．edu．en 第4期 赵丽娇等：荧光法和液相色谱一质谱联用法测定司莫司汀导致A．DNA交联率的比较研究477 在37℃进行反应。在反应的前3h，每隔30 h，每隔1 min取样20“L，在4—10h取样20肛L，每个样品各 mmol／LTris—HCl，1mmol／LEDTA， 取3个平行样。取出的DNA样品均分别加入4mL稀释缓冲液(10 pH74)以终止反应，并置于4℃保存。待反应结束后，从所有DNA样品中各转移出两份溶液，每份16“L， 均加入4ktL0．1 min后， 置于96℃变性5min，随后迅速放入冰水混合物中，O℃淬火8rain。所有样品于室温下静置5 factor,CF％)。 测定其荧光值，并计算DNA交联率(Crosslinking 2．2．2HPLC-ESI-MS法检测交联率向250 XDNA中分别加入2，4，8和16mmol／L的司莫司汀， mg／L 37℃进行反应。在o，2，4，68和10h时分别取样200“L，置于一20℃保存。向取出的所有DNA样品 I，100 DNase 20mmol／L， 中分别加入10此脱氧核糖核酸酶I(DNaseu)，20“L I缓冲液(CH3COONa NaCl150 sl核酸酶(200 S1核酸酶缓冲液(CI-13COONa10mmol／L，