稳定沉默Raptor表达的前列腺癌DU145细胞株的构建论文.pdfVIP

· 346。 安徽 医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2013Apr；48(4) 稳定沉默 Raptor表达的前列腺癌 DU145细胞株的构建 潘腾飞，陈先国，梁朝朝 摘要 目的 应用 RNA干扰技术降低前列腺癌 DU145细 用奠定了基础 。 胞株 Raptor基因表达水平，并建立稳定转染细胞株。方法 1 材料与方法 针对 Raptor基因设计合成 siRNA，鉴定、测序正确后转染 293T细胞观察基因表达情况；构建 Raptor—shRNA慢病毒载 1．1 材料 人前列腺癌 DUI45细胞、293T细胞、 体；进行Raptor—shRNA慢病毒包装及滴度测定；筛选稳定表 pGCSIL—PUR载体均购 自上海吉凯基因技术有限公 达 Raptor—shRNA的前列腺癌 DU145细胞株；Westernblot检 司；Raptor(GI引物合成、测序亦由上海 测稳定转染细胞中的Raptor表达水平。结果 Raptor—shR— 吉凯基因技术有限公司完成；RPMI一1640培养基、胎 NA成功转染前列腺癌 DU145细胞后，通过嘌呤霉素筛选， 牛血清、胰酶消化液均购 自美国Hyclone公司；兔抗 获得了Raptor基因沉默的DU145细胞株 ，Westernblot检测 人Raptor多克隆抗体、puromycin购 自美国Sigma公 证实该细胞株 的 Raptor表达水平 明显低于对 照组 (P 司。 0．01)。结论 成功构建稳定沉默 Raptor表达的前列腺癌 DU145细胞株，为后续研究奠定了基础。 1．2 方法 关键词 shRNA；Raptor；前列腺癌；DU145 1．2．1 Raptor基 因设计及合成 siRNA序列 依照 中图分类号 R737．25 Sarbassovetal 设计的Raptor．shRNA序列，由上海 文献标志码 A 文章编号 1000—1492(2013)04—0346—03 吉凯基因技术有限公司合成、纯化及测序。人 Rap— tor—shRNA上游序列为：5一CCGGAGCGCCCTGCTAC 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetof TCGCTITITI’CTCGAGAAAAGCGAGTAGCAGGGCCCTF rapamycin，mTOR)是一个由2549个氨基酸组成，分 TITrG一3；下游序列为：5．AATTCAAAAAAGGGCCC 子量为289ku的丝／苏氨酸蛋 白激酶，在细胞生长、 TGCTACTCGCrr兀TCTCGAGAAAAGCGAGTAGCAGG 增殖、分化、周期调控等多个方面起 “中心调节”作 GCCCT-3 。 用。mTOR存在两种不 同复合体，即 mTORC1 1．2．2 构建Raptor-shRNA慢病毒载体 将上述筛 (InT0R．raptor)和 mTORC2 (mTOR．rictor)…。 选的Raptor—shRNA有效序列合成、退火形成 shRNA mTORC1主要调节细胞的生长、凋亡、代谢、自噬； DNA双链，双酶切载体进行连接反应，转化感受态 mTORC2可能与细胞 的骨架形成和细胞存活相 大肠杆菌，挑选阳性菌落进行 PCR，由上海吉凯基 关 J。mTOR的过度激活，与许多肿瘤的发生发展 因技术有限公司进行测序鉴定，证实 Raptor．shRNA 密切相关。Raptor在肿瘤 的发生发展 中起重要作