2010年微生态会议交流材料--规模化鸡场产气荚膜梭菌普查及其基因分型和微生态防治研究.pptVIP

规模化鸡场产气荚膜梭菌普查及其基因分型和微生态防治研究 产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌，能引起动物坏死性肠炎(Necrotic enteritis, NE)，人类食物中毒等。 C perfringens是一种条件性致病菌，能产生多种致病作用的外毒素,其中α、β、ε和ι是主要的致死性毒素。 各型C perfringens 均产生α毒素，对家禽致病的主要是A型或C型, A型产生α毒素，造成禽类NE和亚临床感染。 全世界主要养禽国家都存在C perfringens 引起的NE,尤其是欧美等发达国家,随着抗生素促生长剂(AGP)的禁用,发病越来越严重。 虽然该病在我国还未见大规模发病的报道，但是，随着抗生素的限用，甚至禁用，该病在我国的发生和危害必然会日益严重。 我国是一个养禽大国,出口的禽类制品多次因药物残留和病原菌污染受罚,已造成巨大的经济和名誉损失。 第一部分：流行现状普查 健康鸡群普查： 从8个市区10个规模化鸡场，采集500个新鲜粪便和100个盲肠内容物样品。 发病鸡普查： 从5个市区6个规模化鸡场，采集肠炎或腹泻症状鸡小肠内容物和新鲜粪便、肝、脾、心脏等样品共93份。 气荚膜梭菌的分离与纯化 菌落接种紫牛乳后可见爆裂发酵现象，即牛乳凝固，同时产生的大量气体使凝块变成蜂窝状。 不同来源的分离结果 第二部分 产气荚膜梭菌的基因分型 毒素抗毒素中和试验 (Sterne Batty,1975). ELISA（Nagahama, et al,1991） PCR（Fach,1993） 复合PCR 检测α和肠毒素基因（Kanakara R,1998） 特异性PCR 检测α、β、ε毒素基因（Miserez R, 1998） Multi-PCR 毒素分型（Yoo, et al,1997） PFGE 毒素分亚型（Maslanka, et al,1999) AFLP 分亚型 ( B.E. Engstrom, et al,2003) Multi-PCR 的特异性 Multi-PCR鉴定及分型结果 不同日龄来源菌株的REP-PCR 不同组织来源菌株的REP-PCR 不同日龄来源菌株的ERIC-PCR 不同组织来源菌株的ERIC-PCR 第三部分 建立产气荚膜梭菌感染模型 NetB基因检测结果 胶原蛋白酶活力检测结果 产气荚膜梭菌种内拮抗结果 免疫程序：第7d接种鸡新支二联苗，第14d接种鸡法氏囊苗。 球虫卵囊攻毒：在15d时经口灌喂球虫卵囊的液体1mL。 产气荚膜梭菌攻毒：在17d-20d，每天经口灌喂含一定数量的菌液1mL。 饲料：玉米-豆粕型基础日粮，用于饲养1d到13d雏鸡； 55%小麦含量的日粮，用于饲养14d到25d雏鸡。 动物试验一： 将96只1日龄雏鸡随机分成6组： 动物试验二： 将50只1日龄雏鸡随机分成5组： 动物试验三： 将40只1日龄雏鸡随机分成2组： 回肠组织学检测 四川规模化鸡场分离的75株产气荚膜梭菌NetB基因检出率为0。 产气荚膜梭菌CVCC2030能引起雏鸡回肠组织损伤和回肠菌群失调，但不引起严重的坏死。 球虫感染能促进产气荚膜梭菌的增殖。 第四部分 微生态防治产气荚膜梭菌病 体外筛选拮抗产气荚膜梭的芽孢杆菌 生长性能 生长性能 芽孢杆菌H2预防使用 对28日龄感染鸡回肠菌群的影响 芽孢杆菌H2治疗使用 对28日龄感染鸡回肠菌群的影响 芽孢杆菌H2预防使用 对14日龄鸡回肠菌群结构及多样性影响 芽孢杆菌H2预防使用 对21日龄鸡回肠菌群结构及多样性影响 芽孢杆菌H2预防使用 对28日龄鸡回肠菌群结构及多样性影响 芽孢杆菌H2治疗使用 对14日龄鸡回肠菌群结构及多样性影响 免疫器官指数 免疫器官指数 2、外周血白细胞数量变化 回肠组织细胞因子表达量变化 感染试验 14日龄时感染组IFN-α，IFN-γ，IL-1β，IL-6与空白组表达量无显著差异； 21日龄时,感染组IFN-γ，IL-1β水平明显高于空白组（P0.01），IFN-α，IL-6水平略高于空白组但IFN-α差异不显著（P0.05）; 23日龄时,感染组IFN-γ，IL-1β，IL-6表达水平明显高于空白组（P0.01），IFN-α水平差异不显著； 25日龄时，感染组只有IFN-γ水平高于空白组（P0.05），其他因子略有差异，但差异无统