小型猪急性心肌梗死模型血管再生的实验研究.doc

附件2 作者姓名：吕慧霞 论文题目：小型猪急性心肌梗死模型血管再生的实验研究 中 文 摘 要 前言 冠心病是严重威胁人类健康的常见病和多发病，治疗性血管生成是治疗冠心病的新思路和方法。然而，应用单一血管生长因子的临床试验结果并不理想。如何筛选不同促血管生长因子的最佳组合并建立长期稳定的有功能的血管网络对于心肌梗死后心肌灌注的改善和心功能的恢复至关重要。而选用适宜的动物模型，亦是将临床前研究转化为临床应用的重要环节。此外，对于评价心肌灌注跨壁梯度的定量变化目前尚缺乏可靠的技术，应变和应变率显像技术能够实时测量心肌应变和应变率跨壁梯度分布。然而，不同病理生理状态下心肌纵向应变和应变率的分层分布特点及其与心肌灌注跨壁梯度的关系目前尚不清楚。 本研究拟建立与人类冠心病相似的小型猪心肌缺血和梗死模型，通过联合应用不同的促血管生成因子，诱导成熟、稳定的动脉血管网络的形成，进而改善缺血心肌的灌注和功能。同时，应用应变率显像技术定量测量心室肌不同层次的纵向收缩功能，籍此无创性估测心肌灌注的跨壁梯度。这些研究预期将为心肌缺血的早期诊断和和有效治疗提供具有临床应用光明前景的新方法。 目的 在小鼠角膜模型中，将不同血管生长因子两两组合进行初步筛选，确定有协同促血管生成效应的不同生长因子之间的组合。 根据筛选结果进一步探讨最佳组合因子在小型猪心肌缺血和梗死模型中的治疗效果，进而探讨其分子机制。 在小型猪心肌缺血和梗死模型中，观察不同状态下（正常、缺血和梗死节段）心肌的内、外膜层纵向应变和应变率的变化特点。 探讨心肌纵向应变和应变率的跨壁梯度与心肌跨壁血流量的关系。 方法 1. 最佳血管生成组合因子的筛选 角膜是没有血管的组织，因此它是研究血管生成的理想模型。以hydron聚合体包被蔗糖硫酸铝制作缓释系统，利用该系统包载不同血管生长因子使其成为缓释剂，置入小鼠角膜。观察新生血管外形和轮廓的变化，确定有协同促血管生成作用的生长因子的组合。并根据筛选结果在小型猪急性心肌梗死模型中做进一步研究。 2. 心肌缺血和梗死动物模型的建立 中国实验用小型猪40只，结扎冠状动脉前降支制作急性心肌梗死模型，随机分为四组：PBS组, FGF-2组, PDGF-BB组和FGF-2/PDGF-BB组。将PBS或不同血管生长因子缓释剂。 3. 心肌灌注的评价 6周和14周行冠状动脉造影评价LAD分布区的侧支循环；（10?±?2?μm，E-Z Trac,Los Angeles,CA）来评估这三个时间点的Qm= (Cm x Qr) / Cr，其中，Q m 是指每克心肌组织的血流量(ml/min/g), C m 是指每克心肌组织的彩色微粒数, Q r 是指参考血样的抽取速度 (ml/min), C r 是指参考血样中的彩色微粒数。 4. 心肌收缩功能的评价 14周将动物于开胸状态下行心外膜超声检测。在心尖两腔和四腔心切面采以校正的Simpsons方法测定左心室射血分数（LVEF）。在二维灰阶图像上分别测定梗死边缘的缺血区（心电图R波峰值处）（心电图T波末端），（wall thickening,WT）：WT＝（－）/×100％。 5. 病理学和免疫组织化学分析 14周后处死动物，通过兔多克隆抗体von Willebrand factor (vWF) 和小鼠单克隆抗体α-smooth muscle actin (α-SMA)免疫组化标记缺血区心肌的新生毛细血管和小动脉，并用荧光双标来评价新生血管的成熟程度和稳定性。本研究提出了一个新参数：成熟指数（maturation index），即被平滑肌包被的新生血管所占所有血管的百分比。 6．心肌灌注跨壁梯度的估测 在结扎冠脉1小时确定模型建立成功后，应用新型的应变和应变率显像技术，获取6个心动周期的动态图像，定量分析正常、缺血和梗死节段的心内膜和心外膜下心肌的同步应变和应变率曲线。计算心内外膜下层心肌测值的比值，作为内外膜应变和应变率的跨壁梯度。以缺血区域的心内膜和心外膜下层的TVI图像进行重复性分析，测量室间隔缺血区的Sp和SRp，检验这两个定量指标在观察者内部与观察者之间的差异。 7. 统计学分析 在做分析之前，对所有的数据进行正态分布检验。多组之间的比较用Kruskal-Wallis 检验，组间两两比较Mann-Whitney检验。不同节段的MBF, Sp and SRp应用one-way ANOVA比较，组间两两比较进一步用LSD分析。同一节段心内外膜下层参数用配对t检验比较。采用相关回归分析检验Sp 和SRp与相应部位的MBF的相关性。 结果 1. 最佳血管生长因子组合的筛选 将不同生长因子缓释剂置入小鼠角膜第5天的检测结果表明，无论单独应用一种还是联合两种生长因子均可诱导角膜新生血管的形成。与单一因子比较，VEGF/FGF-