刺参候选耐寒基因的克隆与表达分析分析.pdfVIP

Masteral Dissertation Gene cloning and expression analysis of cold tolerant related genes in Apostichopus japonicus Master Candidate: Li Chengze Supervisor: Professor: Chang Yaqing College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University Dalina, P.R.China June, 2014 本论文由 国家自然科学基金 刺参耐寒相关基因筛选及表达研究 (项目编号 国家海洋公益海冰检测项目 渤海海冰立体监测及高精度预警报技术 研究示范 (项目编号：201105016) 资助 摘要 摘要 刺参主产于我国北方沿海地区，是我国北方棘皮动物养殖的重要经济种类， 其营养价值很高，而且还有广泛的药用价值。温度会影响刺参的生存、生长发育 和繁殖，研究环境温度对刺参的生长、生存和生理等的影响，可以为评估在低温 下刺参的生长状态以及开展刺参的安全养殖提供一些基础依据。近年来，低温病 害使我国北方海水养殖业遭受了巨大损失，沿海冬季低温冰害对刺参养殖业造成 的危害亟待解决。本研究模拟了刺参冬季养殖环境，对刺参进行室内降温试验， 从本实验室构建的刺参耐寒基因筛选cDNA 中挑选候选耐寒基因，研究其在低 温胁迫下的表达量。为了解刺参耐低温基因的表达模式及其机理研究，培育刺参 抗寒优良品种提供了大量依据，有利于提高我国刺参抗逆分子育种的研究水平， 减少低温冰害对我国北方刺参养殖业造成的损失。 本试验利用cDNA 末端快速扩增(RACE)技术，对未得到全长的基因尿苷胞 苷激酶-1 基因进行了克隆，将尿苷胞苷激酶-1 基因的核心序列片段和RACE 克 隆的3 端和5 端的cDNA 进行拼接后获得了刺参尿苷胞苷激酶-1 基因的全长。 该cDNA 全长为3189bp，5′非编码区（Untranslated Region,UTR ）126bp，3′非编 码区1506bp，开放阅读框ORF 为1557 bp。可编码518 个氨基酸的前体蛋白， 预测蛋白分子质量为58.2KD，理论等电点是6.50 。尿苷胞苷激酶-1 的518 个氨 基酸中强碱性氨基酸（K ，R ）有66 个，强酸性氨基酸（D ，E ）有72 个，疏水 氨基酸(A, I, L, F, W, V)有177 个，不带电荷的极性氨基酸有(N, C, Q, S, T, Y)有 117 个，分子式为C2590H4120N710O773S21 。其不稳定系数为67.4，总平均亲水性为 -0.301 。并且对尿苷胞苷激酶-1 预测跨膜域，结果表明其有明显的跨膜区，有可 能属于跨膜蛋白类。 在实验室构建的低温双向抑制消减cDNA 文库中筛选出7 个（铁蛋白、转 铁蛋白、溶菌酶、热休克蛋白70、gp96、尿苷胞苷激酶-1 和Toll 样受体）与低 温胁迫相关的基因在不同组织、不同降温模式下各温度进行定量表达分析，我们 发现这些基因在受到低温胁迫后，基因表达量出现大幅度变化，这说明刺参的非 特异性免疫系统在受到低温刺激的状态下通过基因表达量的改变积极应对低温 对其的作用。骤降缓降处理均引起基因表达量的变化，主要发现三种表达趋势： 第一种也是最主要的趋势为先降低后升高；第二种是降低后维持在稳定水平；第 三种先升高后降低这种表达趋势较少。比较同一个基因在骤降和缓降组中的表达 趋势，主要分为：第一种