MDA7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的.docVIP

　　MDA7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的 【摘要】 构建一种端粒酶启动子调控目的基因MDA7/hIL24表达的复制缺陷型腺病毒，并初步探索其抗肿瘤活性。方法： 通过基因操作技术将启动子（hTERTp）+目的基因(MDA7)插入到5型腺病毒E1A区域，构建复制缺陷型腺病毒AdTPmda7；同时构建对照病毒AdTPEGFP。TCID50法测定病毒滴度。应用蛋白质印迹法检测MDA7在肿瘤细胞株中的表达状态；通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤差异。结果： 成功构建携带目的基因的腺病毒载体，PCR鉴定正确；蛋白质印迹结果表明MDA7选择性地在多种肿瘤细胞株中表达,诱导肿瘤细胞凋亡，如A549，SGC7901等，在以相同MOI值感染原代成纤维细胞时，原代细胞中没有检测到MDA7表达；结晶紫染色试验结果表明AdTPmda7对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于对照病毒AdTPEGFP。结论： 成功构建复制缺陷型腺病毒AdTPmda7，并证实MDA7蛋白在肿瘤细胞中过表达诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡。 【关键词】 复制缺陷型腺病毒 端粒酶启动子 肿瘤基因治疗 ［Abstract］ Objective: To develop a proliferationdeficient adenovirus for gene therapy in oter or cells.Methods： A tumorspecific proliferationdifficient adenovirus vector ploying the human telomerase reverse transcriptase (hTERT)promoter to drive the expression of adenovirusmediated target gene; at the same time AdSuTPEGFP ethod.The expression of MDA7 or cell lines MHCC, SGC7901, A549, and so on, and induced apoptosis，ary lung fibroblast da7 da7, ultaneously verified that the overexpression of MDA7 in tumor cells induced tumor cell apoptosis, and significant for targeted tumor gene therapy. ［Key erase reverse transcriptase（hTERT）promoter； tumortargeted gene therapy 黑色素瘤分化相关基因7（MDA7），是1995年由哥伦比亚大学Jiang等［1］通过差减杂交方法从干扰素和瑞香素诱导的终末分化的人黑色素瘤细胞HO1中分离获得的一种新基因，具有肿瘤抑制因子和细胞因子活性。2001年根据其基因定位和分子结构将其归为IL10家族，重命名为IL24［2］。研究发现MDA7蛋白对多种人肿瘤细胞（包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤、肠癌和神经胶质瘤等）的生长均有抑制作用，并可抑制血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞没有影响［3］。 增殖性腺病毒在肿瘤研究方面具有很好的理论优势，但是人体内环境是一个极其复杂神秘的整体，考虑到安全性，我们选择构建复制缺陷型腺病毒。端粒酶阳性表达是人类实体瘤的重要特性，在85％以上的肿瘤细胞中端粒酶表达阳性，而在绝大多数正常体细胞中为阴性［3］。利用这一特性，我们设计构建一种复制缺陷型腺病毒AdTPmda7，用人端粒酶反转录酶启动子（hTERTp）调控MDA7蛋白表达，更好地实现MDA7对肿瘤细胞的杀伤效应，为肿瘤的基因治疗和临床研究提供依据。 1 材料和方法 1.1 实验材料 人肺腺癌细胞株（A549）、人胃癌细胞株（SGC7901）购于中国科学院上海细胞研究所。人原代肺成纤维细胞由本室培养保存。胎牛血清、DMEM、RPMI1640购自美国Gibco BRL公司。pUC19,pDC312,DH5α、携带EGFP报告基因的腺病毒载体质粒pAdTPEGFP、含有5型腺病毒右臂基因组且E1/E3区缺失的腺病毒骨架质粒pBHGE3由本实验室保存。转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。限制性内切酶、T4连接酶系TaKaRa大连生物技术有限公司产品。抗MDA7抗体购自美国RD公司。 目的基因（MDA7）引物（P1：3′CGGCTAGCACCATGAATTTTCAACAGA5