mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细.docVIP

　　mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细 【摘要】 目的： 构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，体外转染小鼠肺癌细胞株LeGITRL基因，克隆至pIRES2-eGFP载体，选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染LeGITRL，基因测序与GenBank中发表的序列完全一致，体外转染LeGITRL。结论： 成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，并在小鼠LeGITRL gene pIRES2-eGFP/mGITRL and transfect it into LeGITRL gene plified from intermediate vector PMD18-T/mGITRL by PCR and inserted into pIRES2-eGFP vector, and the sequence of DNA GITRL gene id pIRES2-eGFP/mGITRL ology RNA for mGITRL in GenBank. mGITRL gene and the protein could be detected by RT-PCR and FCM in the transfected LeGITRL vector has been constructed successfully and or necrosis factor receptor ligand； cell transfection； tumor 　　肿瘤严重危害人类健康，免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要手段。研究发现调节性T细胞抑制效应性T细胞，在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用，体内清除调节性T细胞则有利于抗肿瘤免疫应答［1］。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）是胸腺的CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的重要表面标志，其配体（GITR ligand, GITRL）具有解除Treg免疫抑制功能的作用［2］。本研究构建pIRES2-eGFP/mGITRL真核表达质粒，体外转染小鼠肺癌细胞株LeGITRL（eBioscience 公司），Trizol及逆转录试剂盒（Invitrogene公司），DNA聚合酶，dNTP，EcoRⅠ及SalⅠ核酸内切酶，DL2 000，λ-EcoT14Ⅰdigest DNA相对分子质量标准（Takara Biotec公司），PCR产物纯化试剂盒（Macherey-Nagel公司），质粒提取试剂盒（Axygen公司），大肠杆菌DH5α，Leer Premier5.0软件设计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列：上游引物：5′-GAGAATTCATGGAGGAAATGCCTTGAG-3′,下游引物：5′-CCCGTCGACCTAAGAGATGAATGGTAGATC-3′，引物中增加了EcoRⅠ（GAATTC）及SalⅠ（GTCGAC）2个酶切位点。 　　1.3 pIRES2-EGFP/mGITRL 克隆及鉴定 　　以mGITRL-TA质粒［3］（本室保存）为模板，通过PCR扩增获得mGITRL基因。PCR反应体系包括2.5 μl 10×缓冲液，2 μl 2.5 mmol/L MgCl2，2.5 μl 2 mmol/L dNTP，2 μl模板，0.25 μl Ex Taq酶（5 U/μl），1 μl上游引物及下游引物，13.75 μl H2O，总体积25 μl。PCR反应条件为94℃预变性2.5 min,然后94℃变性30 s，62 ℃退火30 s,72℃延伸1 min，共进行35个循环，再72℃延伸5 min。PCR扩增产物通过Macherey-Nagel公司的Nucleospin试剂盒进行纯化。用EcoRⅠ和SalⅠ分别对上述纯化产物及pIRES2-eGFP进行双酶切，分别进行胶回收，回收的目的片段和载体在室温下利用T4DNA连接酶连接1 h，连接产物转化DH5α宿主菌后，接种含50 μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单个菌落，转种LB培养基（含50 μg/ml卡那霉素），抽提质粒，酶切，电泳鉴定。 　　将经过鉴定的阳性重组质粒，通过通用引物进行双向反应测序，将测定的核苷酸序列与基因库中原有的序列比较分析。 　　将测序正确的pIRES2-eGFP/mGITRL质粒的DH5α菌株大量扩增，并严格按照Axygen试剂盒里说明书抽提质粒，同时抽提pIRES2-eGFP质粒以作为阴性对照。 　　1.4 LeGITRL及pIRES2-eGFP(对照组质粒)分别转染Le