MLH1基因在喉鳞癌中的表达及意义.docVIP

　　MLH1基因在喉鳞癌中的表达及意义 【摘要】 目的：探讨人喉鳞癌中MLH1基因的表达及意义。方法：采用免疫组化法分别检测20例喉癌组织及癌旁组织MLH1基因的表达。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对MLH1基因的表达进行定量分析。结果：喉癌癌细胞核和细胞质中可见少量的棕黄色颗粒, MLH1基因表达弱;对照组中,细胞核及细胞质中可见一些棕黄色颗粒, MLH1基因表达强。图像分析结果显示: 喉癌组MLH1基因表达的平均光密度为0.0694±0.0018, 对照组MLH1基因表达的平均光密度为0.2518±0.0257;喉癌组MLH1基因表达的阳性面积率为0.0738±0.0021, 对照组MLH1基因表达的阳性面积率为0.3257±0.0350，经单因素分析喉癌组与对照组比较，差异有显著性(Plt;0.05)。结论：MLH1基因在喉癌组织中表达降低,可能在喉癌的发生机制中起了一定的作用。 【关键词】 喉鳞癌; 人类错配修复基因; 免疫组织化学 MLH1是人类错配修复基因( human mismatch repair gene, hMMR)家族中一个重要的基因，MMR对保持遗传信息的完整性和稳定性，避免遗传突变的产生具有重要作用，MLH1的功能缺陷被认为是肿瘤发病的重要机制, 成为近年来研究的热点。研究表明，MMR与结直肠癌、食管癌、胃癌、宫颈癌等关系密切[1，2]，但在喉癌中的表达状况报道甚少。本实验通过免疫组化方法检测喉癌和癌旁组织中MLH1基因的表达状况，探讨它与喉癌临床病理特征的关系。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 材料 收集武汉市中心医院病理科2007～2009年喉癌存档蜡块20例，其中男性18例，女性2例。所有切片经病理学专家诊断为喉鳞状细胞癌，所有病例均为首次发病，并且均是术前未接受过放疗、化疗的病人。另取瘤组织周围组织5例(癌旁组织选自手术切除标本远离肿瘤端,切缘经病理证实未见癌细胞)作对照。 　　1.1.2 材料分组 将实验分为喉癌组和对照组。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　1.2.1 主要试剂 浓缩型鼠抗人MLH1基因单克隆抗体,(北京中山生物技术有限公司);超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。 　　1.2.2 主要仪器 YLH1相关抗原 　　具体步骤： 　　① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 　　② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min; 　　③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 　　④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景; 　　⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min; 　　⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 　　⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 　　⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5min)，自来水冲洗终止反应; 　　⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝; 　　⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检; 　　用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。 　　1.3.3 免疫组织化学结果判断 　　MLH1基因以胞核或胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。 　　采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对MLH1基因的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。 　　1.4 统计学处理 　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。 　　2 结果 　　喉癌癌细胞核和细胞质中可见少量的棕黄色颗粒, MLH1基因表达弱;对照组中,细胞核及细胞质中可见一些棕黄色颗粒, MLH1基因表达强。图像分析结果显示: