中药对乳酸杆菌与解脲脲原体临床分离株的体外抑制实.docVIP

　　中药对乳酸杆菌与解脲脲原体临床分离株的体外抑制实 【摘要】 目的测定7味中药对解脲脲原体（Uu）临床分离株及乳酸杆菌的影响。方法用微量稀释法测定柴胡、蛇床子、苦参、黄连、槐花、野菊花、夏枯草对Uu临床株的最小抑菌浓度（MIC值）以及体外抑制乳酸杆菌的抑菌圈直径。结果黄连、夏枯草对Uu较高敏感，MIC90均为7.81 mg/ml；蛇床子、槐花、野菊花中度敏感，MIC90为31.25～62.5 mg/ml；柴胡、苦参不敏感。黄连对乳酸杆菌的抑菌圈直径为8 mm，其它中药均为0 mm。红霉素对Uu敏感率为29.41%，对乳酸杆菌抑菌圈直径为22 mm。结论7味中药体外对Uu有不同程度的抑制作用，对乳酸杆菌无影响。红霉素体外对Uu及乳酸杆菌均有抑制作用。 【关键词】 解脲脲原体; 乳酸杆菌； 中药； 最小抑菌浓度 解脲脲原体（Ureaplasma urealyticm, Uu）是泌尿生殖道感染的常见病原体之一，它不仅引起非淋球菌性尿道炎，还可引起泌尿生殖道多种疾病，如阴道炎、宫颈炎、盆腔炎、不孕不育等。目前西药治疗首选四环素类、喹诺酮类及大环内酯类，但随着耐药株的增加，加之强效广谱抗菌素反复应用引起的副作用、菌群失调等，使本病治疗面临重重困难。本实验在原有的基础上，探讨中药体外对Uu与乳酸杆菌的作用，旨在为治疗Uu感染找到更好的药物。 　　1 材料与仪器 　　1.1 菌株17株Uu临床分离株及干酪乳杆菌干酪亚种均于同济医院性病研究中心实验室。 　　1.2 药物中草药：柴胡、蛇床子、苦参、黄连、槐花、野菊花、夏枯草水煎剂1g/ml（即每毫升相当于1 g生药），由上海市中医医院制剂室制备。西药：红霉素批号050601(上海先锋药业有限公司)，由同济医院性病研究中心实验室制备。 　　1.3 仪器及试剂工作净化台（TDGC2j-0.5和TDGC2j-1/0.5）、手提式压力蒸气灭菌器（YXQ.SG41.280）、CO2培养箱（SHEL LRB2300）、液氮生物容器、显微镜（CH30RF200）、Uu液体培养基、96孔细胞培养板等。 　　2 方法 　　2.1 中草药煎剂制备方法分别称取柴胡、黄连、夏枯草等7味药材，加入500 ml水，浸泡1 h，电炉煎煮，沸后30 min，过滤，沉渣加水煎煮，再过滤，两液混合，浓缩至1∶1，离心取上清液，调整pH值至（6.0±0.5），高压灭菌10 min，备用。 　　2.2 乳酸杆菌培养基制备方法参照凌代文［1］《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》。 　　2.3 最小抑菌浓度（MIC值）测定方法微量稀释法测定中草药煎剂的MIC值：Uu培养及其CCU（颜色改变单位）测定按文献（Robertson JA,1982）方法［2］，中草药煎剂的MIC测定按文献(Kenny GE,1986)方法略加改进。 　　2.3.1 菌液准备将Uu株复苏后，传代3次，取第3代对数生长期（106CCU/ml），稀释20倍作为工作菌液。 　　2.3.2 加Uu液体培养基在96孔 (8×12)板上第1孔加培养基150 μl,第12孔加200 μl,第2～11孔各加100 μl。 　　2.3.3 加药物第1，2行第1孔各加药物50 μl。 　　2.3.4 倍比稀释药物从第1孔开始，用微量移液器吹打混匀，吸出100 μl至下一孔，再混匀，依次类推，直至第10孔。这样药物浓度从第1～10孔依次为250 mg/ml、125 mg/ml、……，共10个浓度。 　　2.3.5 加Uu菌液第1～11孔各加100 μl。第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。 　　2.3.6 MIC值的判定将培养板盖上板盖，置于37℃恒温培养箱中孵育。当第11孔阳性对照孔明显生长（孔内颜色由黄色变为红色）时，开始判读结果，以不出现颜色变化（无Uu生长）孔的最小药物浓度为抗Uu的MIC值。 　　2.4 抑菌圈直径测定方法琼脂倾注法测定抑菌圈直径，方法如下。 　　2.4.1 菌液准备将乳酸杆菌菌液连续传代3次，加入无菌生理盐水比浊到1.5×108/ml，作为工作菌液。 　　2.4.2 加菌液取1 ml工作菌液，平铺于圆形平皿上。 　　2.4.3 加培养基将琼脂培养基熔化后，倾注于圆形平皿中轻摇混匀。 　　2.4.4 打孔待琼脂培养基凝集后，用打孔器在上面打孔，中间1孔，周边6孔。 　　2.4.5 加药物中间孔加入红霉素50 μl，周边孔加入不同浓度的中药水煎剂50 μl。 　　2.4.6 测量抑菌圈的直径培养18 h后观察，如药物无抑菌作用，则孔周围长满乳酸杆菌，如有抑菌作用，则孔周围无乳酸杆菌生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直径。 　　2.5 统计学分析所有实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计学分析，本实验为计量资料，采用方差分析及组间比较法。 　　3 结果 　　3