人大肠癌抗原基因 cDNA噬菌体表达文库的构建和.docVIP

　　人大肠癌抗原基因 cDNA噬菌体表达文库的构建和 【摘要】 　　目的: 为获得大肠癌的特异性抗原基因, 构建人大肠癌抗原基因的 cDNA噬菌体表达文库。方法: 从2株人大肠癌细胞CCL187和CX1中提取总RNA, 分离纯化mRNA, 并以此为模板合成第1 链 cDNA, 用置换法合成第2 链 cDNA。双链 cDNA 经末端削平、 EcoRⅠ接头连接、 XhoⅠ 酶切、 过柱分级分离, 除去lt;400 bp 片段。收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接, 体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。结果: 构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库, 原始库容量为2.3×109 pfu/L, 重组率97%。重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上。结论: 成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库, 为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础。 【关键词】 人大肠癌; 噬菌体; cDNA表达文库 　　［Abstract］ AIM: To construct a cDNA phage expression library of colorectal carcinoma antigens for screening colorectal carcinoma specificantigens. METHODS: The total RNA ta cell lines CCL187 and CX1 . The mRNA from total RNA ini erase. The blunted cDNAs all cDNA molecules（lt;400 bp）oved through size fraction. After the cDNAs ary ent a cDNA phage expression library is excellent and helpful to screen colorectal carcinoma specificantigens. 　　［Keya; bacteriophage; cDNA expression library 　　大肠癌是消化系统的常见恶性肿瘤之一, 死亡率有逐年上升的趋势。因此早期诊断和治疗是提高大肠癌治愈率的关键［1］。我们已成功制备了以人大肠癌细胞系CCL187为免疫源的鼠抗人大肠癌单克隆抗体(mAb) ND1［2］, 进一步筛选和鉴定ND1 mAb所识别的特异性大肠癌抗原, 可为大肠癌早期诊断和免疫治疗提供新的靶点。而寻找抗原基因的最有效方法是构建cDNA文库 , 继而进行筛选、 克隆。国内外已开展大肠癌cDNA文库构建和大肠癌相关肿瘤抗原筛选方面的研究［3, 4］。本实验中用2株人大肠癌细胞系CCL187和CX1作为构建文库的材料, 以λ ZAP Express为载体, 构建了人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 CCL187和CX1人大肠癌细胞株由美国哈佛大学医学院肿瘤所惠赠。TRIzol试剂购自美国Invitrogen 公司; DMEM培养基购自Gibco公司; mRNA分离纯化试剂盒购自德国Qiagen公司; ZAP Express cDNA Synthesis Kit和ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 购自美国Stratagene 公司。LB 培养基胰蛋白冻、 酵母提取物购自 Oxoid LTD; 盐酸四环素购自 Amresco 公司; 异丙基硫代βD半乳糖苷 (IPTG) 、 5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷( Xgal)为TaKaRa公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 RNA提取和纯化 培养人大肠癌细胞CCL187和CX1至对数生长期, 倒去培养液, 用PBS冲洗后加入TRIzol试剂, 裂解细胞并抽提总RNA, 用Qiagen的mRNA分离纯化试剂盒分离纯化mRNA, 用紫外分光光度计测定其A260/A280比值及含量, 用MOPS甲醛变性凝胶电泳观察完整性。 　　1.2.2 cDNA 合成 按Stratagene公司试剂盒说明书进行。取5 μg 纯化的mRNA样品作为模板, 用50个碱基的寡聚核苷酸为合成引物, 序列为5′GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA ACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′（下划线处为Xho I 酶切位点）, 加逆转录酶StrataScriptRT（MMLV）, 混匀后42℃水浴1 h, 逆转录合成 cDNA第1链。置换法用RNaseH将mRNA降解成小片段作为引物合成 c