人胎膜体外孵育方法研究.docVIP

　　人胎膜体外孵育方法研究 【关键词】人胎 　　摘要:目的探讨人胎膜体外孵育的方法，为进一步研究胎膜的结构和功能提供一种新的方法。方法取20例正常选择性剖宫产者的胎膜，在DMEM.F-12培养基中进行孵育，共孵育96h，每24h换液并测定胎膜的存活力，48h后一部分胎膜分别给予细菌内毒素脂多糖（LPS）和LPS+N-乙酰半胱氨酸（NAC）刺激孵育中的胎膜24h。苏木精-伊红染色观察细胞形态，免疫组化方法检测各时间点胎膜中的基质金属酶-9（MMP-9）的表达情况，了解胎膜细胞的功能。结果20例胎膜的平均存活力24h为87%±1.9%，48h为85%±1.3%，72h为83%±1.6%，96h为37%±1.2%;前三者两两比较无统计学差异（Pgt;0.05），前三者分别与96h组比较均有统计学差异（Plt;0.05）。苏木精-伊红染色观察细胞形态变化，0～72h细胞形态良好、饱满，72h后细胞开始皱缩，至96h大部分细胞死亡。免疫组化示0h及48h的胎膜MMP-9的表达微弱，24h的MMP-9表达较前增强，LPS作用后MMP-9的表达明显增强，同时给予LPS+NAC的MMP-9表达又明显下降。结论DMEM.F-12培养基体外孵育胎膜是可行的，且方法简单。 　　关键词:胎膜;体外孵育;方法;脂多糖;N-乙酰半胱氨酸 　　胎膜在整个妊娠中发挥着重要的作用，一旦胎膜的结构和功能发生变化，妊娠将不能维持;但是胎膜的结构和功能的某些变化在临床出现症状（如胎膜早破）前往往不为人所发觉，因此体外孵育胎膜进一步研究其结构和功能将有非常重要的意义。本实验建立了一种简单、可行的体外孵育胎膜的方法。 　　1资料和方法 　　1.1胎膜所有胎膜均于东南大学附属中大医院妇产科2004年10月―2005年3月单胎足月择期剖宫产的孕妇（20例），孕妇无妊娠合并症及并发症，也无临产征兆，所有孕妇除接受麻醉药外未接受其他药物治疗。排除有感染征象（血、尿常规有白细胞升高，C反应蛋白异常升高，体温高于正常，胎膜经苏木精-伊红染色后每高倍视野白细胞超过5个）及有过自然早产或早产并发胎膜早破史者，以及此次妊娠用过抗生素者。 　　1.2方法 　　1.2.1胎膜的取材及孵育剖宫产胎盘取出后10min内进行取材，所取的胎膜位于胎盘边缘和破口之间，包含绒毛膜和羊膜两层，大小约10cm×10cm，取材之前先用生理盐水纱布尽可能擦去胎膜表面的血液，取下后立即放入装有Hanks液（4℃）的瓶中，10min内送至实验室后在超净台内把所取的胎膜放入装有Hanks液的培养皿中进行反复漂洗，直至肉眼观察无血液，再用DMEM.F-12培养液洗1次，然后把胎膜剪成24块0.6cm×0.6cm大小，放入装有DMEM.F-12培养液（含1×105U.L青霉素，0.1g.L链霉素）的24孔培养板中，每孔1块组织，加培养液2ml。培养板置5%CO2、95%O2、37℃的培养箱中进行孵育，共孵育96h，每24h换液1次。孵育48h后其中的8块胎膜再分别给予脂多糖（LPS，0.1mg.L，由O55:B5型菌株产生，Sigma公司，北京中杉公司代理）和LPS+N-乙酰半胱氨酸（NAC，10mmol.L，Sigma公司，北京中杉公司代理）作用24h。 　　1.2.2胎膜存活力检测胎膜存活力检测每24h为一个检测点，即24、48、72和96h。在每个检测点，用CytoTox96Non-RadioactiveCytotoxicity试验检测培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）含量，孵育后的胎膜用1%TritonX-100计算其LDH的最大产量，胎膜存活力=100×〔（1-培养基中产生的LDH的量）.胎膜中应产生的LDH最大量〕，最后计算各时点20例孵育胎膜的平均存活力。 　　1.2.3苏木精-伊红染色及免疫组化苏木精-伊红染色及免疫组化均增加一个0h时点，免疫组化取消了96h时点，其中72h组又分成LPS组和LPS+NAC组。每组孵育的胎膜经10%中性甲醛固定24h，石蜡包埋，4μm连续切片，经苏木精-伊红染色进行细胞的形态学观察。免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）连接法，操作步骤按试剂盒说明进行，二氨基联苯胺（DAB）显色（MMP-9单克隆一抗及SP法试剂盒为北京中杉公司产品）。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗，按同前步骤平行操作，其染色作为阴性对照。 　　染色阳性为细胞质出现棕黄色颗粒。采用半定量积分法，根据切片阳性细胞率和阳性细胞着色强度分别计分。阳性细胞率以计数5个高倍视野为准，≤5%计0分，6%～30%计1分，31%～50%计2分，≥51%计3分。基本未着色，染色强度与背景相似者，计0分;着色浅，略高于背景色，计1分;中等着色，明显高于背景色，计2分;