组织均质是现今最常被利用於体外药物相关研究的实验方法之.PDFVIP

第三節、微粒體酶 製備 ( microsomes preparation ) 組織均質是現今最常被利用於體外藥物相關研究的實驗方法之 一，而藥物代謝與細胞色素 P450 的相關試驗又以肝臟均質法最為常人 所用。在肝臟均質的製備過程中，所使用的儀器及溶液均需儲放於4℃ 的環境中，除此之外為了避免酵素蛋白的去活化，操作中的肝均質液所 處環境，不論在製備或離心的過程中都不可超過4。 實驗動物以較為人道方式犧牲 (例：頸椎脫臼術)，當中不可使用任 何藥物或化學物質，以避免肝臟中酵素的活性或含量受到外來因素的影 響而產生變異，因此常用於實驗動物犧牲的藥劑，諸如：乙醚 (ether)、 氯仿 (chloroform) 或巴比妥鹽類 (Barbiturate) 麻醉劑等都應避免使 用，本研究之實驗動物為大鼠，因此進行藥物代謝之酵素也取自於鼠肝 均質液，首先，動物犧牲後立即將肝臟取出，並置放於4℃的 1.15 %氯 化鉀 (sodium potassium) 溶液中，以清除組織中多餘的血液並降低其溫 度以適合保存，洗滌後將肝臟瀝乾並予以秤重紀錄，並加入四倍肝重的 1.15 %氯化鉀 (sodium potassium) 溶液，以高速均質機進行均質直到溶 液中不再有塊狀肝組織出現為止，均質管必須先行放置碎冰中預冷，但 應避免管壁結霜。 待均質完全後分裝於離心管內設定12500 g初步離心20 分鐘以去 除多餘的細胞外組織，離心後小心取出上層液，內含可溶性肝微粒體、 102 肝細胞、細胞碎片、細胞核及粒腺體等胞器，實驗所需的細胞微粒體部 分，可由初步離心所得到的上層液進行超高速離心而製成：將適才所得 之上層液分裝於超高速離心管，每管約5~6 ml 並將鋁製帽蓋旋緊，設定 100,000 g 超高速離心2 小時，離心完成後去除管內上清液，並以 1.15 % 氯化鉀 (sodium potassium) 溶液清洗管底之微粒體膠狀顆粒 (pellet)，並 清除管內殘存之離心上清液，洗滌後將微粒體膠狀顆粒 (pellet) 取下， 加入與肝等重之pH 7.4, 0.1M 磷酸緩衝液，並進行第二次均質以得到濃 度為 100 % (W/W) 微粒體懸浮液。 製備完成之微粒體懸浮液，其蛋白質含量約為25 g / per ml 肝均質 液，將懸浮液儲放於 -80℃ 冷凍庫，約可維持酵素活性八週而不致有影 響性的改變，經由上述對於微粒體酵素之製程所製備之懸浮液，即可應 用於藥物代謝之研究，實驗中所使用之微粒體酵素應盡快於時限內運 用，以避免產生嚴重的誤差而錯判實驗結果。 製備流程將簡略說明於【圖二十五】，在Gibson Skett (1994)文獻中也 具有完整而詳細的討論。 103 (1) Animal sacrifice (spinal cord dislocation) ↓ (2) 取肝臟 ↓ (3) 以KCl (1.15 %) 清洗後秤重 ↓ (4) 剪碎後加入KCl (1.15 %)，重量比(肝：KCl ＝1：4) ↓ (5) 均質完全 ↓ (6) 置入高速離心管，每管約 12~15ml ↓ (7) 高速離心 4, 20min, 12500g ↓ (8) 取上清液置入超高速離心