5.6章分子生物学方法.ppt

5·4·l DNA片段的产生与分离 从实验材料中制备包括“目的基因”在内的DNA片段群体，必须包容整个基因组的全部序列，DNA片段的大小要适合于基因操作的要求。 鸟枪法(shot-gun approach)：限制性内切酶消化供体基因组DNA，直接将消化产物与载体分子相连接。重组体分子带有大小不同的插入片段。 真核基因组庞大，载体承受外源DNA插入为1000～3000bp，将产生几十万个大小不同的DNA片段，这些大小不同的DNA片段形成的重组体分子组成相应克隆群体。要想从如此巨大的群体中选出带有目的基因的克隆太费事。 5·4·l DNA片段的产生与分离 局部双酶消化法可以保证DNA产物大小在10～30kb左右，通过离心或制备凝胶电泳技术，得到约为20kb的随机群体并将其克隆到合适的载体上，克服鸟枪法的困难。 5·4·l DNA片段的产生与分离 5·4·2 重组体DNA分子的构建 1·外源DNA片段定向插入载体分子： 载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对(NE1和NE2) 切割，二者将按一种取向退火形成重组DNA分子，保证外源DNA片段定向插入载体分子。 若载体分子和外源DNA插入片段不能产生出互补的粘性末端，则采用附加衔接物的办法来提高平末端之间的连接效率。 5·4·2 重组体DNA分子的构建 2·最佳连接反应 经限制性内切酶切割后的线性载体分子的自身不允许再环化。采用碱性磷酸酯酶处理由内切酶消化产生的线性载体分子，除去该DNA的5’-P末端，而留下一个5’-OH基团。当插入了外源DNA片段，其5’为-P末端，从而能有效重组。 在连接反应中，使用正确的载体DNA和外源DNA的比例，是获得高产重组转化子的重要因素。 用λ噬菌体或柯斯质粒作载体时，配制高比值的载体DNA/供体DNA的连接反应体系有利于重组分子的形成。 用质粒作为克隆载体，其重组体分子由一个载体分子和一个供体DNA片段连接环化而成，当载体DNA与供体DNA的比值为1时，有利于这类重组体分子的形成。 2·最佳连接反应 3·重组体分子导入受体细胞的途径 将外源重组体分子导入受体细胞的主要途径包括转化(或转染)、转导、显微注射和电穿孔等。转化和转导主要适用于细菌一类原核细胞和酵母等低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动物的真核细胞。在基因工程中有详细介绍。 5·4·3 cDNA基因克隆 真核生物基因组DNA大，含有大量的重复序列和内含子，难以直接分离到目的基因。通过RT-PCR可以部分解决。 高等生物一般具有3～5万种左右不同的基因，在一定时间阶段的单个细胞或组织中，仅有15%左右的基因得以表达，产生出约5000～10000种不同的mRNA分子。 cDNA克隆的基本过程是通过一系列酶催作用，使总poly(A)mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 5·4·3 cDNA基因克隆 5·4·3 cDNA基因克隆 可应用Promega PolyAT tract mRNA分离系统分离poly(A)mRNA。将用生物素标识的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。 1·高质量mRNA的制备 5·4·3 cDNA基因克隆 mRNA5’——————————AAAA 互补21-CCC———————— TTTT-20 21-GGG 所有包含Poly(A)尾巴的mRNA被反转录生成cDNA。 以21和20为引物做PCR： 21－－－－－－－－－－AAAA-20互补 互补21—————————————20 2·反转录生成cDNA 5·4·3 cDNA基因克隆 双链cDNA群体插入载体： 21－－－－－－－－－－AAAA-20互补 互补21—————————————20 设计21时，让其有酶1的切点，20有酶2的切点，在质粒载体上有相应的切点，就可以定相将所有PCR片段插入载体。 3、重组体分子的构建及转化寄主菌株 转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 载体分子有抗药性基因，在培养基中加入相应的抗生素进行筛选。 5·4·3 cDNA基因克隆 经过特殊处理的具有吸收外源DNA能力的细菌细胞为感受态细胞。 当重组质粒分子与感受态细胞混合，感受态细胞数量 》重组质粒分子时，在培养基上长出的单菌落是由一个重组质粒分子导入一个细菌细胞后经过繁殖而形成的。 5·4·3 cDNA基因克隆 在组织和培养的细胞中，一个细胞中有些mRNA可拥有数千个拷贝，而有些mRNA只有几个拷贝。根据mRNA分子含量的多寡