细胞分裂素检测方法的研究进展.docVIP

　　细胞分裂素检测方法的研究进展 【摘要】 细胞分裂素是一类重要的植物生长调节激素，对这类激素进行超微定量检测对于揭示其在植物体内的信号转导机理、发挥其对作物生长的调控作用具有重要意义。本文综述了近年来细胞分裂素各种分析方法的研究进展，包括免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和电化学方法等，介绍了实际样品常用的前处理方法，并讨论了未来的研究发展方向。 【关键词】 细胞分裂素，免疫分析法，色谱法，毛细管电泳法，样品预处理，评述 　　1 引 言 　　细胞分裂素(cytokinins，CTKs)是一类重要的植物生长调节激素，在植物体内广泛参与各种生物过程。CTKs可以促进植物根部的形成，以及根部损伤的修复[1]。CTKs还影响叶绿体的制造和微结构[2]，影响植物的光合作用和病原抵抗[3]等。目前, 已被确认的CTKs有40余种[4], 所有的天然CTKs都是腺嘌呤衍生物。表1列出了典型CTKs的结构、名称和简称。根据其6位N原子(N6)上取代基(R1)的不同，常见的CTKs可分为3类: 异戊二烯型、异戊二烯衍生型和芳香型[4]。同时，根据其R2的不同又可以将其分为自由碱基型、核苷型、葡萄糖苷型和核苷酸型等。另外还存在3位N原子或7位N原子上葡萄糖基取代的CTKs[5]。 　　CTKs在植物体内主要产生于RNA代谢过程[6]，生物学家已经能够通过调节相关基因的表达来控制内源CTKs的含量[7]，但是进一步确定CTKs对植物生长的作用还需要准确的内源性CTKs定量分析方法。另外，植物体内的异戊烯基腺嘌呤(iP)等CTKs的浓度还可以作为反映植物生长环境状况和疾病情况的标志物[8]。 　　生物测试法(bioassays)是最早采用的CTKs测定方法[9]，但是这种方法的专一性和重复性都较差，分析过程复杂、工作量大，适合作为CTKs的定性分析方法，为理化分析方法提供生物活性方面的依据。 　　由于CTKs在植物体内含量非常低(约为pmol/g)，因此，需要高灵敏度的定量分析方法和高选择性的纯化富集样品前处理方法对其进行分析。本文将从这两方面进行论述。 　　2 分析方法 　　2.1 免疫分析方法 　　免疫分析方法具有高效液相色谱法(HPLC)等仪器分析方法所不及的优势及特点：(1) 由于免疫反应的特异性，可用粗提产品直接检测，从而显著提高了测试速度;(2) 免疫分析对特殊仪器的需求较少，分析成本较低;(3) 免疫分析方法的灵敏度高。由于这些优点，免疫分析方法一直在CTKs检测中广泛应用[10～21]。异戊烯基腺苷(iPR)和反式玉米素核苷(tZR)作为免疫分析研究中的半抗原，所制得的抗体对N6上的取代基有较好的识别，即对于与半抗原R1不同的分子交叉反应较小。 　　最早用于CTKs测定的免疫分析方法是放射性标记的免疫分析法(RIA)[10～13]，分别实现了对iPR类[10]和ZR类[11]CTKs的定量检测。其中aldiney等[15]将生物素亲和素体系引入ZR的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法，使得检出限可以达到3～5 pg，线性范围在1～1000 pg，利用这种技术可以检测100 mg西红柿样品中的ZR含量。Zhao等[16]提出了一种简化的间接竞争ELISA法，将抗体、竞争分子和酶标二抗在同一步中加入，可以缩短检测时间，同时在一定程度上提高了灵敏度(对ZR为1.3倍)，但该方法的试剂消耗量更大。 　　由于CTKs都是小分子，因此在制备抗体时需先将CTKs与载体蛋白(如牛血清白蛋白(BSA)，鸡卵白蛋白(OVA)等)偶联制得全抗原。文献[10～20]中所采用的偶联方法都是Erlanger等[22]建立的核苷类分子与蛋白分子上的自由氨基共价偶联的方法(如图1所示)。Papet等[21]研究了iPR与蛋白的另一种偶联方法。ELISA和RIA的检测结果表明，这种偶联方法制得的多克隆抗体对iPR和iP具有专一性，与Z和ZR没有交叉反应。进一步使用这种抗体制得免疫亲和吸附胶，对iPR的吸附容量达到1 mg/L。 　　图1 嘌呤核苷与蛋白的偶联方法[22] 　　Fig.1 Conjunction of adenosine to protein[22]2.2 气相色谱法(GC) 　　由于CTKs分子挥发性较弱，无法直接用气相色谱(GC)方法来分离检测，所以对CTKs进行GC分离检测都需要先经过衍生化[23～29]。Most 等[23]首次报道了三甲基硅烷(TMS)衍生物用于CTKs的GC分离检测。分别制备了iP、玉米素、二氢玉米素、激动素及其相应核苷的衍生物。制备方法为：将iP等化合物与双(三甲基硅烷)乙酰胺(BTMSA)在60 ℃的乙腈溶液中反应5 min。衍生前样品需要经过严格的干燥。虽然这种衍生方法比较简便，但由于在实际操作中