细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒.docVIP

　　细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒 【摘要】 　　目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1（DMT1）编码基因的重组腺病毒。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1IRE的cDNA，亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中，形成转移质粒pAdTrackCMVDMT1IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组，利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆，经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1DMT1IRE。线性化的重组质粒转染HEK293细胞，获得高滴度的重组腺病毒。结果 RTPCR反应扩增出1 841 bp的片段，重组质粒阳性克隆pAdEasy1DMT1IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段，PCR鉴定扩增出DMT1的片段，证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因DMT1IRE。转染293细胞后细胞表达GFP荧光，显示293细胞稳定表达外源性的DMT1IRE基因。结论 携带DMT1IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功，获得高滴度的重组腺病毒，为DMT1基因进一步功能的研究提供基础。 【关键词】 阳离子转运蛋白质类 重组 遗传 腺病毒科 　　［ABSTRACT］ Objective To construct a rebinant adenovirus containing gene of DMT1 id pAdTrackCMV containing green fluorescent protein (GFP) reporter gene, folloid pAdTrackCMVDMT1IRE by Pme Ⅰ digestion and subsequent cotransformation into E.coli BJ5183 cells along id pAdEasy1. The rebinant plasmid pAd easy1DMT1IRE ycin resistance. The rebination pAdeasy1DMT1IRE inal repeats. Pac Ⅰdigested pAdEasy1DMT1IRE ent, plus a smaller fragment of 4.5 kb digested by Pac Ⅰ. PCR, shoicroscopy. Conclusion The rebinant adenovirus is successfully constructed and can efficiently express DMT1 ologous rebination; Rebinant adenovirus 　　近年来的研究显示，帕金森病（PD）病人脑内有铁代谢的改变，铁离子含量在黑质致密带显著增高，而在黑质网状带无明显变化[1,2]。但铁在黑质的选择性聚积的原因至今还不是十分清楚。新的铁转运蛋白的发现是铁代谢领域的重大突破，为解释这一问题提供了重要的理论依据。二价金属离子转运蛋白1（DMT1）曾被称为具有天然抗性的巨噬细胞蛋白2（Nramp2），是新近发现的铁转运蛋白[3]。研究发现DMT1在脑内广泛表达[4]，提示DMT1在脑铁转运中起到非常重要的作用，可能参与了黑质内的铁聚积。本研究构建了携带DMT1IRE的重组腺病毒，为研究DMT1在铁聚积中的作用提供实验依据，有利于进一步阐明PD的神经元损伤机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　实验能用携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdeasy1，大肠杆菌BJ5183、JM109和DH10B由本室保存。兔抗鼠DMT1IRE单克隆抗体购自Alpha Diagnostic公司。βactin抗体为Sigma公司产品，HRP标记的goat antirabbit IgG购自中山公司。人胚肾293细胞由本室保存。人胚肾293细胞用含体积分数为0.10的胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液，于37 ℃、体积分数0.05 CO2温箱中培养。 　　1.2 方法 　　1.2.1 RTPCR扩增目的基因 应用Trizol提取RNA, 应用巢式PCR的方法扩增DMT1IRE基因，外侧引物：5′AGGGTACCTCTAAGAACTCAGCCACTCAG3′，3′GGATACCCGAACACAGAACTTCGAACCA5′；内侧引物：5′AAGGTACCACCATGGTGCTGG