结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及.docVIP

　　结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及 【关键词】 分枝杆菌,结核；Rv2389；基因表达 　　Construction and expression of eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Rv2389 　　【Abstract】AIM: To construct the eukaryotic expression vector encoding Mycobacterium tuberculosis Rv2389 and express it in CHO cells. METHODS: The gene encoding Rv2389 protein plified by polymerase chain reaction（PCR）from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain. After sequenced, Rv2389 gene segments id pCDNARv2389 e. The expressions of mRNA and protein encoded by this gene munofluoresent technology. RESULTS: Rv2389 RNA and protein levels id encoding Rv2389 ent established the basis for further study on the function of Rv2389. 　　【Keyycobacterium tuberculosis; Rv2389; gene expression 　　【摘要】目的：构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体. 方法：PCR扩增Rv2389基因，测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)，重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RTPCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果：构建了重组质粒pCDNA Rv2389， RTPCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录，间接免疫荧光检测证明，表达有Rv2389蛋白的细胞着染. 结论：成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNARv2389，Rv2389基因可以在CHO细胞中表达. 　　【关键词】 分枝杆菌，结核；Rv2389；基因表达 　　0引言 　　 　　结核病是目前危害全球人类健康的重要传染病. 这主要是因为① 卡介苗（BCG）对成年人结核病的预防效果不稳定，保护力为0%~70%；② 没有特异性的诊断试剂；③ 艾滋病等免疫缺陷个体的出现加快了本病的严重后果；④ 耐药菌株的大量出现［1］. 因而寻找更有效的替代卡介苗的疫苗已成为当务之急. Rv2389蛋白是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB) 复活促进因子（resuscitationpromoting factor, Rpf）样蛋白家族的一员，序列分析发现，它不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原［2］. 为此，我们在Rv2389原核表达和纯化的基础上，构建了真核表达载体并在CHO( 中国仓鼠卵巢)细胞中进行表达，同时从其表达水平和基因转录两方面进行鉴定，为其功能研究奠定基础. 　　1材料和方法 　　1.1材料MTB H37Rv菌株,P815细胞由本室保存；真核表达载体pCDNA3.1(-)由本室保存；含有Rv2389基因的重组质粒pPro EX HTRv2389由本室构建保存；Rv2389蛋白多抗由本实验室制备；AMV，RNA 酶抑制剂和TRIzol（Promega公司）；限制性内切酶、T4 DNA连接酶和核酸分子质量标准品（宝泰克公司）；质粒提取试剂盒（Omega公司）；梭华soft阳离子聚合物（厦门太阳马公司）；羊抗鼠荧光抗体（宝信公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1Rv2389基因片段的扩增与测序结核分枝杆菌Rv2389全基因序列的特异性引物序列为：P1：5′gga tcc gcc acc atg acc ccg ggt ttg ctt ac3′，含BamHⅠ酶切位点，起始码和cozak序列；P2：5′ccg aag ctt atc gtc cct gct ccc cga tga3′，含HindⅢ酶切位点和终止码. PCR反应条件：94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，72℃延伸10 min. 回收PCR产物，用T4连接酶将PCR产物与pGEMTeasy载体连接，转化E.coli DH5α，随机挑取5个克隆提取