超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究.docVIP

　　超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究 【摘要】 目的： 使用超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO）对成肌细胞进行体外标记，探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响. 方法： 常规方法进行成肌细胞培养，应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞，用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响，台盼蓝染色及JC1观测SPIO对细胞活力的影响. 结果： 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒，单纯SPIO标记有效率为50%，脂质体包被的SPIO标记有效率为100%，电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒. SPIO标记对细胞无毒性，不影响细胞的增殖及活性. 结论： 脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒，可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究. 【关键词】 成肌细胞 超顺磁性氧化铁 磁共振成像 　　0引言 　　生物治疗是改善和缓解终末期缺血性心脏病的理想手段，其中以细胞移植最有临床应用前景［1］. 但需要解决一个重要问题是植入细胞的存活、迁移如何识别和动态监测. MR显微成像是最近出现的显微影像技术，具有较高的分辨率，能够分辨近似于细胞大小的组织［2］,理论上能够动态跟踪移植细胞. 但目标细胞必须经MR对比剂标记后才能与背景组织区别而被MR检测到. 超顺磁性氧化铁纳米粒子（superparamagic oxide iron particle, SPIO）是一种新型磁共振对比剂，本研究我们探讨SPIO标记成肌细胞方法及其对细胞增殖分化的影响，为临床利用MRI技术无创监测移植细胞在心脏内的存活和迁移奠定基础. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　SD乳大鼠. DMEM培养基, 小牛血清(FBS), 脂质体2000, JC1（Molecular probes）均为美国Gibco公司产品. Endorem：超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO市售制剂，11.2 mg Fe2+/mL），由荷兰鹿特丹Erasmus大学医学中心放射线科张卓立博士后提供. CO2培养箱、光学显微镜、荧光显微镜及透射电镜. 　　1.2方法 　　1.2.1成肌细胞分离培养 　　将出生3 d以内的SD大鼠颈椎脱位法处死， 无菌条件下取双下肢肌肉， DHanks液洗去残血，祛除筋膜等周围组织，用含抗生素的无血清培养液冲洗2次，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小肌肉碎块， 无血清培养液冲 洗2次， 静置1 min并去上层液及飘浮组织. 加5倍体积2 g/L Ⅰ型胶原酶，37℃ 水浴消化50 min， 2000 r/min离心10 min，去上清液，底层细胞和碎片用DMEM洗2次，制成骨骼肌单细胞悬液，再加5倍体积2.5 g/L胰蛋白酶，37℃ 水浴消化30 min，释放位于骨骼肌肌膜的成肌细胞，加入150 mL/L FBS的DMEM培养液8 mL阻止酶消化，2700 r/min离心10 min，去上清，重悬细胞离心去上清，反复4次，最后一次用2 mL不含FBS的DMEM重悬细胞，采用Percoll（细胞分离液）非连续密度梯度离心法除去成纤维细胞，将所得细胞加入150 mL/L FBS的DMEM培养基中，吹匀、计数，接种于内置处理过的盖玻片的培养板中. 　　1.2.2脂质体包被SPIO方法 　　30 μL脂质体2000稀释于0.5 mL OptiMEM血清培养基中为管1，总量含112 μg Fe2+的Endorem(SPIO)稀释于0.5 mL OptiMEM血清培养基中为管2， 5 min后混合管1及管2并室温放置20 min，获得脂质体包被SPIO的混悬液. 总量含112 μg Fe2+的Endorem稀释于1 mL OptiMEM血清培养基，获得单纯SPIO的混悬液. 　　1.2.3SPIO标记 　　成肌细胞提取传代（第2代）后第2日生长较活跃的成肌细胞，将单纯SPIO混合液及脂质体包被SPIO混合液分别加入含1×106成肌细胞的9 mL OptiMEM中（11.2 μg Fe2+/mL），37℃, 50 mL/L CO2培养箱中共同培养23 h，即可得标记成肌细胞. 　　1.2.4SPIO标记的检测 　　① 光学显微镜检测： 利用普鲁氏兰可使SPIO铁离子染色并在普通光学显微镜下可以观察到的特点，用普鲁氏兰对SPIO标记的成肌细胞及脂质体包被SPIO标记的成肌细胞进行染色. 具体方法为：将标记成肌细胞移入内置处理过的盖玻片的六孔培养板中. 1 h后待细胞充分贴壁后，取出盖玻片，DHanks液洗涤3遍，40 g/L多聚甲醛固定20 min，蒸馏水洗涤2遍，Perls反应液（等体积200 mL/L盐酸与100 g/L亚铁氰化钾新鲜配制）染色20 min，蒸馏水洗涤2遍，5 g/L伊红复染