金钗石斛提取物对晶状体上皮细胞氧化损伤防护作用.docVIP

　　金钗石斛提取物对晶状体上皮细胞氧化损伤防护作用 【摘要】 　　目的：探讨中药金钗石斛提取物中4种不同极性的生物碱（脂溶性、水溶性、低极性、弱极性）对人晶状体上皮细胞（HLEC）氧化损伤防护作用的影响。方法：将H2O2与传代培养的HLEC共同孵育复制氧化损伤模型，同时加入不同极性的金钗石斛提取物作用24h后，用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测HLEC的增殖情况，流式细胞术检测其凋亡情况，并探讨不同极性及同一极性不同浓度的金钗石斛提取物对氧化损伤后细胞增殖及凋亡的影响。结果：H2O2组LEC增殖下降，金钗石斛脂溶性生物碱和水溶性生物碱高剂量组可促进氧化损伤的LEC的增殖，其中脂溶性生物碱显著增强氧化损伤的LEC的增殖（Plt;0.01）。脂溶性生物碱可以明显抑制H2O2诱导的LEC凋亡（Plt;0.01）。结论：金钗石斛脂溶性生物碱低剂量组通过抗氧化损伤而促进LEC的增殖，抑制LEC的调亡。 【关键词】 金钗石斛； 生物碱；氧化损伤 　　Abstract AIM:To investigate the protection of different polarity alkaloids (fatsoluble, dendrobium nobile on H2O2 induced damage of human lens epithelial cells (HLEC)．METHODS:The H2O2 and HLEC age model . At the same time the different polarity alkaloid dendrobium nobile can enhance the proliferation of LEC by antioxidation, and inhibit the apoptosis of LEC.  　　KEYEM培养基、乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶(trypsin)、四甲基偶氮唑蓝(MTr)、DMSO 1.3实验仪器均购自华美生物工程公司，分别是美国Sigma公司、美国GIBCO公司、美国Augus公司和美国Amreseo公司产品。E52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵(河南巩义市英峪予华仪器厂)；BP221S电子分析天平（上海精密仪器表有限公司）CO2培养箱(美国FORMA 2111)，倒置研究显微镜(日本IMT413)，全自动酶标仪(BioTek ELX 808)。 　　1.2　方法 　　金钗石斛洗净、烘干、粉碎，其粉末经乙醇提取、降膜浓缩、酸化、盐析、萃取后；水洗、回收可得脂溶性生物碱；酸化、氯仿萃取回收获得弱极性生物碱；将酸化后并用氯仿萃取的酸水层浓缩再碱化回收得低极性生物碱；碱化后用正丁醇萃取、饱和水洗回收获得水溶性生物碱。人晶状体上皮细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃，50mL/L CO2培养箱内培养，细胞形态呈多角形或梭形，3～4d可融合。融合成片的细胞，大小较一致。细胞生长接近融合时及时传代或冻存，按1∶3～4分瓶传代。实验分组：（1）正常组:正常HLEC+DMEM维持液；（2）模型组：正常组+500μmol/L H2O2；（3）高浓度脂溶性生物碱组：模型损伤晶状体上皮+高浓度（25μg/L）脂溶性生物碱;（4）低浓度脂溶性生物碱：模型组损伤晶状体上皮+低浓度（12μg/L）脂溶性生物碱;（5）高浓度的水溶性生物碱：模型组损伤晶状体上皮+高浓度（25μg/L）的水溶性生物碱;（6）低浓度的水溶性生物碱组：模型组损伤晶状体上皮+低浓度（12μg/L）的水溶性生物碱；（7）高浓度低级性生物碱组：模型组损伤晶状体上皮+高浓度（25μg/L）低级性生物碱；（8）低浓度低级性生物碱组：模型组损伤晶状体上皮+低浓度（12μg/L）低级性生物碱;（9）高浓度弱极性生物碱组：模型组损伤晶状体上皮+高浓度（25μg/L）弱极性生物碱；（10）低浓度弱极性生物碱组：阳性组+低浓度（12μg/L）弱极性生物碱。MTT法检测不同极性生物碱对HLEC增殖的影响：消化并收集生长良好、呈对数生长期的HLEC,接种于96孔板培养板中，细胞密度为8×103个/mL,置于37℃，50mL/L CO2培养箱中培养24h后，弃去培养液，按照上述实验分组，各极性生物碱浓度分别为25μg和12μg。继续培养24h后，弃去培养液，在各组培养板分别加入200μL的MTT试剂（终浓度为0.5g/L），继续培养4h。吸去MTT溶液，加入150μL DMSO溶液，振荡器轻轻振荡10min后，于全自动酶标仪上490nm波长比色测定，测定各组的吸光值，即D值。按下列公式计算抑制率。抑制率(%)=(增殖组平均D值各药物组平均D值